苏云金芽胞杆菌增强子结合蛋白(bEBPs)的功能研究

摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是革兰氏阳性芽胞杆菌，在形成芽胞的同时产生伴胞晶体，伴胞晶体主要成分是杀虫晶体蛋白（Cry蛋白），对多种农林害虫具有特异性毒杀活性，因其安全、高效等特点在害虫的生物防治领域获得了广泛的应用。苏云金芽胞杆菌HD73是应用上有重要作用的库斯塔克亚种代表菌株之一。Sigma54是细菌中调控许多重要代谢途径的Sigma因子，课题组前期研究发现，苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种HD73菌株中，编码Sigma54(Sigma L)的sigL基因缺失后，Cry蛋白产量明显下降，Sigma54可能通过其控制的某些代谢途径影响了Cry蛋白的产量。依赖于Sigma54的转录需要增强子结合蛋白（bacteria Enhancer Binding Proteins，简称bEBPs）的激活才能起始，Sigma54调控的代谢途径受bEBPs的控制，本研究初步探索了苏云金芽胞杆菌增强子结合蛋白的功能，主要内容如下。 在Bt HD73全基因组中发现了8种bEBPs，通过保守结构域分析表明均有3个典型的bEBPs蛋白保守结构域:N端感知信号的结构;与Sigma54互作的AAA+结构;与DNA结合的HTH结构。对bEBPs所在基因簇可能参与的代谢途径进行了分析，目前已发现GabR参与γ-氨基丁酸代谢、SoxR参与肌氨酸代谢途径、KamR参与赖氨酸代谢途径。分析发现了RocR可能参与精氨酸代谢，AcoR可能参与3-羟基丁酮的代谢，BkdR可能参与支链脂肪酸的合成途径，LevR可能参与纤维二糖和地衣多糖合成途径，PrdR参与的代谢途径未知。 利用同源重组的方法敲除Bt HD73菌株中5个bEBPs的编码基因，获得了5个bEBPs突变体。对bEBPs突变体进行表型分析，生长曲线测定实验表明:无论是在营养丰富的LB培养基，还是在营养贫瘠的SSM培养基，8个bEBPs编码基因的缺失对菌体生长均无明显影响。运动能力分析表明:sigL基因的缺失对菌体的运动能力有较大影响，gabR和soxR基因的缺失对菌体的运动能力无显著影响，rocR、prdR、kamR、acoR、bkdR和levR基因的缺失对菌体的运动能力有明显影响。芽胞形成率实验表明，sigL基因的缺失对芽胞形成率影响较大，rocR、kamR和soxR基因的缺失对芽胞形成率有较弱的影响。sigL基因的缺失造成Cry蛋白产量下降，而8个bEBPs基因的缺失均对Cry蛋白产量无明显影响。 在bEBPs所在基因簇中，发现有5个启动子受Sigma54控制，将这5个启动子与lacZ基因融合，转化bEBPs突变体中，通过β-半乳糖苷酶活性分析表明，3213（基因编号）、0560、1070、4469和5613基因的转录分别由AcoR、RocR、PrdR、BkdR和LevR激活。 通过RT-PCR确定了Bt HD73菌株中bkd基因簇的转录情况，ptb基因到bkdB基因组成一个转录单元，ptb-bkdB操纵子的转录是受Sigma54的控制，并受BkdR的激活。bkdR突变体互补菌株部分恢复了菌体的运动能力，过表达bkdR基因没有影响菌体的运动能力。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 苏云金芽胞杆菌概述

1．1．1 苏云金芽胞杆菌的特点

1．1．2 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白和芽胞的产生

1．1．3 cry基因的转录调控

1．2 σ54因子概述

1．2．1 σ54和σ70家族的区别和特点

1．2．2 σ54因子的结构特点

1．2．3 σ54因子的作用机制

1．2．4 σ54因子的功能及其调控的代谢途径

1．3 增强子结合蛋白概述

1．3．1 增强子结合蛋白的结构与功能

1．3．2 Bt中的bEBPs

1．4 立题依据与目的意义

1．4．1 立题依据

1．4．2 目的意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 培养基与抗生素

2．1．3 酶与生化试剂

2．1．4 引物序列

2．1．5 溶液和缓冲液

2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 模板制备

2．3．2 目的片段的扩增

2．3．3 重叠PCR

2．3．4 酶切反应

2．3．5 琼脂糖凝胶电泳

2．3．6 大肠杆菌质粒提取

2．3．7 DNA的回收

2．3．8 DNA片段的连接

2．3．9 大肠杆菌热击感受态细胞的制备及转化

2．3．10 苏云金芽胞杆菌电击感受态细胞的制备与转化

2．3．11 序列测定及分析

2．3．12 RT-PCR分析

2．3．13 同源重组突变体的筛选

2．3．14 突变体生长曲线测定

2．3．15 β半乳糖苷酶活性分析

2．3．16 运动能力

2．3．17 芽胞形成率

2．3．18 蛋白定量和SDS-PAGE电泳

2．3．19 光学显微镜观察

3 结果与分析

3．1 bEBPs所在基因簇的序列分析

3．2 bEBPs基因插入失活突变载体的构建及筛选

3．2．1 prdR基因插入失活突变载体的构建及筛选

3．2．2 rocR基因插入失活突变载体的构建

3．2．3 acoR基因插入失活突变载体的构建

3．2．4 bkdR基因插入失活突变载体的构建

3．2．5 levR基因插入失活突变载体的构建

3．3 受bEBPs调控的启动子活性分析

3．4 bEBPs突变体的表型分析

3．4．1 bEBPs突变体的生长比较

3．4．2 bEBPs突变体的运动能力比较

3．4．3 bEBPs突变体的芽胞形成率分析

3．4．4 bEBPs突变体的蛋白产量

3．5 bkd基因簇的转录调控

3．5．1 bkd基因簇的序列分析和RT-PCR分析

3．5．2 bkdR突变体的互补菌株和过表达菌株的构建

3．5．3 野生菌株、突变体、过表达菌株和互补菌株的运动能力比较

4 讨论

4．1 sigL对Bt生长代谢的重要性

4．2 Bt中bEBPs可能参与的代谢途径

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文