融合表达TGEV 6Ds 与PEDV ps420非抗性标记重组干酪乳杆菌表达系统的构建及免疫效果评价

摘要

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪病毒性腹泻的主要病原，二者同属冠状病毒，所致疾病的临床特征相似，并多以混合感染。仔猪感染的死亡率最高可达到100％，给养猪业造成巨大损失。研究表明，黏膜免疫是有效的防治途径。因此，研究能有效预防TGEV与PEDV感染的口服疫苗具有重要的实践意义。
　　本研究以TGEVS蛋白D抗原中和位点的6个核酸重复序列6Ds和PEDV S蛋白中和抗原表位区ps420核酸序列为靶基因，定向插入组成型乳酸乳杆菌表达载体pPG-T7g10-PPT构建了融合表达6Ds-ps420蛋白的重组表达质粒pPG-T7g10-6Ds-ps420。将阳性重组质粒电转入干酪乳杆菌L.casei393，获得了阳性重组干酪乳酸杆菌pPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei393。将重组菌pPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei393在MRS培养液中37℃静置培养16h，经Western-blot检测，目的蛋白获得表达，目的蛋白大小约为80 kDa。在此基础上，以增强型绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因对构建的重组质粒pPG-T7g10-6Ds-ps420进行改造，将EGFP基因与融合基因6Ds-ps420串联，获得了重组质粒pPG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420，电转入干酪乳杆菌L.casei393，获得了阳性重组菌pPG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420/L.casei393。对培养的重组菌进行Western blot和激光共聚焦显微镜检测，结果显示，目的蛋白获得表达。然后，通过酶切方法将重组质粒pPG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420中的抗性标记氯霉素基因切除，平端自连后电转入干酪乳杆菌，通过流式细胞技术筛选非抗性标记（EGFP标记）的重组干酪乳杆菌pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei393。经Western-blot鉴定，重组目的蛋白能够正确表达，大小约为110kDa。
　　本研究以BALB/c小鼠为实验动物，对重组菌pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei393的免疫原性进行初步评价。将小鼠随机分成4组:PPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei393组、pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei393组、pPG-T7g10-PPT/L.casei393空载体组和PBS组。每只小鼠口服免疫2×109 CFU的干酪乳杆菌或200μl PBS，共免疫三次，免疫时间间隔为2周，每次连免3天，每天1次。采集不同时间点各组小鼠血清、粪便和外生殖道黏液样本，利用TGEV和PEDV全病毒作为包被抗原，通过间接ELISA方法检测免疫样本中的抗体水平。检测结果显示，pPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei393免疫组和pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei393免疫组小鼠IgA和IgG抗体水平均显著高于PBS组和pPG-T7g10-PPT/L.casei393组，而pPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei393免疫组和pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei393免疫组之间抗体水平差异不显著。脾淋巴细胞增殖实验结果显示，5μg/mL的TGEV6Ds抗原/PEDV ps420抗原具有显著的促进脾淋巴细胞增殖作用。免疫血清抗体中和病毒活性检测结果显示，pPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei393免疫组小鼠抗血清对TGEV和PEDV的中和效价分别为1∶100和1∶112.2，pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei393免疫组小鼠抗血清对TGEV和PEDV的中和效价分别为1∶63.8和1∶100，组间差异不显著。
　　综上所述，本研究以EGFP为选择标记，成功构建了融合表达TGEV6Ds和PEDV ps420蛋白的非抗性标记重组干酪乳杆菌系统pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei393，经动物免疫实验证实，该重组菌具有良好的免疫原性，为进一步探索新型猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻口服二联疫苗的研制奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 猪传染性胃肠炎的研究现状

1．1．1 病原学

1．1．2 TGEV S蛋白研究进展

1．1．3 TGEV致病与免疫机制

1．2 猪流行性腹泻的研究现状

1．2．1 病原学

1．2．2 PEDV S基因研究进展

1．2．3 PEDV致病与免疫机制

1．3 绿色荧光蛋白的研究进展

1．4 TGE与PED疫苗研究现状

1．4．1 灭活疫苗

1．4．2 弱毒疫苗

1．4．3 基因工程疫苗

1．5 黏膜免疫的研究现状

1．6 乳酸菌作为口服疫苗载体的研究现状

1．7 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种、病毒株、细胞及质粒

2．1．2 抗体

2．1．3 实验动物

2．1．4 主要分子生物学试剂

2．1．5 引物

2．1．6 主要实验仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 目的基因的获得

2．2．2 目的基因片段6Ds-ps420连接

2．2．3 重组干酪乳杆菌的构建

2．2．4 重组干酪乳杆菌Western Blot表达鉴定

2．2．5 表达EGFP-6Ds-ps420融合蛋白干酪乳杆菌的构建

2．2．6 去除抗生素基因的重组干酪乳酸菌的构建及鉴定

2．2．7 重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠特异性抗体的测定

2．2．8 重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠后对脾细胞增殖的影响

2．2．9 中和效价的测定

3 结果与分析

3．1 表达6Ds-ps420重组干酪乳杆菌的构建

3．1．1 6Ds-ps420目的基因的获得

3．1．2 重组质粒pPG-T7g10-6Ds-ps420鉴定结果

3．2 重组干酪乳杆菌表达鉴定结果

3．3 表达EGFP-6Ds-ps420重组干酪乳杆菌的构建

3．3．1 EGFP目的基因的获得

3．3．2 重组质粒pPG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420鉴定结果

3．4 pPG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420／L.casei393表达鉴定结果

3．4．1 Western blot实验鉴定结果

3．4．2 激光共聚焦检测结果

3．5 非抗性重组乳酸菌的筛选

3．5．1 非抗性重组乳酸茵菌落PCR鉴定

3．5．2 氯霉素基因缺失的验证结果

3．6 重组无抗性乳酸菌Western blot鉴定表达结果

3．7 重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠特异性抗体的测定

3．7．1 免疫小鼠粪便中特异性IgA检测结果

3．7．2 免疫小鼠阴道洗液中特异性IgA检测结果

3．7．3 免疫小鼠血清中特异性抗体IgG测定

3．8 脾淋巴细胞增殖试验

3．8．1 TGEV 6Ds蛋白抗原刺激脾淋巴细胞增殖实验

3．8．2 PEDV ps420蛋白抗原刺激脾淋巴细胞增殖实验

3．9 抗体中和效价检测结果

4 讨论

4．1 PEDV和TGEV免疫保护性抗原的选择

4．2 EGFP作为报告基因取代抗药基因

4．3 乳酸菌表达载体的选择

4．4 重组乳酸菌免疫效果评价

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文