番茄rin突变体胎萌的生理机制及rin在胎萌中的作用

摘要

一粒成熟种子能否萌发与其自身所处的生理状态以及周围的环境条件有关。并且仍处于母体植株上正在发育中的种子通常是不能萌发的。但在玉米、高粱、小麦、水稻等部分大田作物上，出现了种子在收获之前于穗上提前萌发的现象，即所谓的穗发芽现象。另外，像甜瓜、佛手瓜、木菠萝、番木瓜、黄瓜、辣椒、茄子、拟南芥、大豆等此类作物也报道过种子在其果实内或荚内早熟萌发的现象。而目前对种子在母体植株上过早萌发的现象，其研究焦点主要集中在禾本科作物上，通过对这种现象的研究鉴定了多种遗传突变体，丰富了育种工作中种质资源的多样性，拓展了种子休眠与萌发的基础理论知识。在蔬菜作物番茄rin果实突变体中也存在这种现象，即果实（种子）在母体植株上发育到一定阶段时，种子在果内已经萌发甚至长出子叶;即使在植株上没有萌发的种子，其果实采收后置于常温下一段时间，种子也能在果实内萌发。这是作物的一种品种特性，并受外界环境条件的影响。
　　过早萌发影响作物的采种与贮存，研究其机理对抑制早熟萌发的应用研究具有指导意义;同时作为一项基础研究，对其机理的揭示再结合顽拗性种子萌发的特点与基础知识，可以对种子休眠和萌发的理论做进一步补充;另外，对过早萌发现象的研究具有十分重要的生态意义:萌发抑制物质的存在有利于种子寿命的延长与保存，这一点对于保护稀有野生植物更有意义。
　　本试验立足于番茄rin果实突变体种子的胎萌现象，研究了番茄种子的发育特性，阐释了与种子早熟萌发相关的生理机制，并对转录因子LeMADS-rin进行了扩增、分析及转化。本论文主要结论如下:
　　通过连续几年的观察及统计分析，番茄rin突变体的部分果实在开花授粉之后大约45天开始发生胎萌现象，此时胎萌种子比例大约为7％左右;开花授粉之后50天时，胎萌种子大约为10％;开花授粉55天时，胎萌种子比例大约为15％-20％;在开花授粉55天之后，果实继续在植株上发育或者采收后置于常温下几周后，胎萌种子继续增多，达到种子总数的45％左右，且此时果实内的黏胶物质被消耗殆尽，出现小的空腔。
　　番茄对照品种发育到一定阶段的种子在脱离果实组织、去掉种子周围包裹的黏性胶原物质之后，置于充足的水分和适宜的温度等条件下即能萌发，这初步表明番茄果实组织对于阻止种子在果实内的萌发起到一定的作用。
　　番茄对照品种各发育阶段的种子在脱离果实组织之后，重新置于被分离的胶原物质中进行离体培养孵育，种子的萌发被完全抑制，这进一步验证了番茄果实组织对种子提前萌发的抑制作用。
　　番茄rin突变体及对照品种发育中的种子能在低浓度的ABA、PEG溶液、PEG和ABA的混合溶液中萌发，随着处理溶液浓度的升高，种子萌发率下降;并且随种子成熟度的增强，其对处理溶液抑制作用的耐受性增强;另外，番茄rin基因突变体比对照品种种子的萌发率低，对ABA及渗透抑制更敏感;同时PEG和ABA二者的混合溶液对种子萌发的抑制更接近于果实胶原物质对种子萌发的影响，且抑制作用主要来源于二者中的PEG提供的渗透抑制。
　　试验表明在几种番茄突变体中，ABA缺失型突变体的种子萌发速度最快;GA缺失型突变体的种子萌发最慢，萌发率最低;而番茄rin突变体和对照品种的种子萌发率相似，介于中间。这表明，种子内源激素(ABA)的缺失会导致种子萌发能力的增强。
　　在整个发育过程中，ABA缺失型突变体种子内的ABA含量是供试品种中最低的，且整个发育过程中没有剧烈的变化;其它三个品种种子内的ABA含量呈现相似的变化规律:先升高，于开花授粉之后50天左右达到最大值，再降低，其含量均高于ABA缺失型突变体种子内的ABA。番茄rin突变体种子内ABA的含量与其胎萌现象的发生没有必然的相关性。
　　在整个发育过程中，ABA缺失型突变体胶原物质内ABA的含量一直处于最低;其它三个品种果实内ABA的含量彼此存在差异，但与番茄rin突变体种子的胎萌现象没有直接关系。
　　随着果实的不断发育成熟，番茄对照品种果实内果汁的渗透摩尔浓度不断升高，而番茄rin突变体果实内果汁的渗透摩尔浓度先升高再降低。在开花授粉45天之后的发育阶段，番茄rin突变体的果实渗透摩尔浓度开始小于对照品种果汁的渗透势，且到果实发育后期，rin突变体果实内果汁的渗透摩尔浓度非常接近于允许种子萌发的最大渗透阈值。这表明rin突变体果实内较低的渗透摩尔浓度为其胎萌现象的发生提供了有利条件。
　　对rin进行扩增，并用swiss-model对其核苷酸序列及所编码的氨基酸序列进行了蛋白质结构和功能区的分析，该基因编码397个氨基酸，包含两类结构域，分别是MADS-box结构域和K-box结构域。其中有4个氨基酸发生了变化，第一、第二个氨基酸变化发生在MADS-box结构域中;第三、第四个氨基酸变化发生在K-box结构域中;且对其蛋白质结构进行了模拟。在此基础上，构建植物过表达载体p35S∷rin以及RNAi载体Ubi∷rin，分别转化番茄。经PCR检测，获得过量表达转基因阳性植株23棵，连续两年种植并对其果实内发育中的种子性状进行统计调查，暂时未发现种子在过表达阳性植株果实内发生胎萌现象。

目录

声明

摘要

1．引言

1．1 本研究的目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 种子休眠与萌发的研究现状

1．2．2 作物胎萌和穗萌现象的研究进展

1．2．3 番茄迟熟突变体的研究进展

1．2．4 转录因子MADS-box基因的研究进展

1．2．5 RNAi概述

1．3 研究内容及技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 生化试剂

2．1．3 主要培养基

2．1．4 仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 番茄rin突变体种子和果实生理特性分析

2．2．2 过表达载体及干扰载体的构建

2．2．3 番茄转化

2．2．4 PCR筛选阳性植株

3 结果与分析

3．1 番茄rin突变体生理特性分析

3．1．1 番茄rin突变体种子胎萌特性分析

3．1．2 番茄发育中的种子的萌发特性

3．1．3 番茄果实胶原物质对种子萌发的影响

3．1．4 ABA溶液、聚乙二醇溶液、及二者相结合对种子萌发的影响

3．1．5 不同番茄品种种子的萌发率

3．1．6 不同番茄品种种子和胶原物质内ABA的含量

3．1．7 番茄果实内的渗透摩尔浓度

3．2 番茄rin突变体rin的扩增、载体构建及转化

3．2．1 rin的扩增及分析

3．2．2 构建过表达载体

3．2．3 构建干扰载体

3．2．4 转化番茄

3．2．5．抗性植株PCR鉴定及性状调查

4．讨论

4．1 番茄果实组织对种子胎萌的抑制作用

4．2 激素缺失(ABA)对种子休眠和萌发的影响

4．3 番茄rin突变体种子胎萌的原因分析

4．4 转录因子LeMADS-rin在rin突变体种子胎萌中的角色

4．5 工作展望

4．6 创新点

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士期间发表的学术论文