水稻冷胁迫应答miR156k的克隆与耐冷功能分析

摘要

水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物之一。低温冷害是影响高寒地区水稻农业生产亟待解决的重要环境因素，萌发期和苗期冷害使种子萌发缓慢、发育不良、分蘖数减少，导致水稻减产或绝收，从而严重影响水稻产量、品质与地理分布。因此了解和揭示水稻早期耐低温分子机理、获得冷胁迫信号通路关键基因、以期通过基因工程手段改良水稻耐冷性和选育水稻耐冷新品种，是增加水稻产量、解决水稻冷害问题对世界食物安全具有十分重要的现实意义。
　　MicroRNA(miRNA)是一类长为21nt左右的单链RNA，在真核生物中广泛存在，具有调控其靶基因表达从而调节植物生长发育、抗逆、代谢等生命过程的功能。miR156k被证明在拟南芥、水稻、玉米以及番茄等植物中参与生长发育的调控，在前期的研究中通过基因芯片分析发现，水稻miR156k在苗期冷胁迫中差异表达，后通过real-time PCR分析miR156k表达特性，验证了芯片分析结果，从而推测miR156k在水稻响应冷胁迫时发挥作用。
　　本研究通过构建pre-miR156k水稻遗传表达载体，对水稻进行遗传转化，获得了pre-miR156k Southern阳性超量表达水稻植株。通过对野生型和超量表达水稻植株萌发期和幼苗期进行冷胁迫处理，研究miR156k在冷胁迫中的功能。利用psRNA Target软件预测miR156k靶基因，通过查找相关文献确定软件预测结果的准确性，并利用miR156k超量表达植株进行real-time PCR分析其靶基因在冷胁迫下的表达模式。进一步通过分析miR156k超量表达植株中冷胁迫Marker基因表达特性、脯氨酸及SOD含量，初步探讨了miR156k水稻冷胁迫反应的分子机制。主要研究结果如下:
　　(1) pre-miR156k在水稻中的过量表达
　　本研究采用农杆菌介导的方法将pre-miR156k表达载体对水稻愈伤组织进行遗传转化，并获得固沙草抗性的水稻植株。通过PCR、southern blot的方法对抗性植株进行了分子生物学检测，获得转pre-miR156k植株。
　　(2) miR156k的耐冷功能分析
　　对Southern阳性的超量表达miR156k T2代转基因水稻及野生型水稻植株在萌发期进行4℃冷胁迫处理，结果表明:miR156k转基因植株与野生型植株种子大小及在对照组均无差异;在冷处理后，野生型水稻萌发率、地上部分长度及根长都明显优于转基因水稻。对转miR156k水稻T2代3叶期幼苗进行4℃冷胁迫处理，结果表明:超量表达miR156k降低了转基因水稻对冷胁迫的耐性，冷胁迫24h后转miR156k水稻的叶卷率高于野生型，而SOD的活性、叶绿素含量和脯氨酸含量在冷胁迫下转基因水稻均明显低于野生型。
　　(3)初步分析miR156k参与的冷胁迫应答分子机制
　　通过对转miR156k水稻和未转基因水稻冷胁迫相关Marker基因的表达模式分析，在冷胁迫下一些冷胁迫相关的Marker基因如脯氨酸合成基因OsP5CS，ROS清除基因Os01g22249在转miR156k水稻中在冷胁迫中表达量有所提高。以上表明超量表达miR156k降低了冷胁迫相关Marker基因及其靶基因的表达量，从而增加了水稻对冷胁迫的敏感性。通过相关文献查找，我们得到了19个miR156k的靶基因。首先实验室前期通过芯片数据分析了这些靶基因的表达特性，为了进一步验证SPL基因的表达量受冷胁迫影响，我们选择了其中的三个基因(SPL3、SPL14和SPL17)进行了表达特性分析。结果表明在9h野生型和转基因水稻中的SPL基因表达量的差异明显。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究的目的和意义

1．2 文献综述

1．2．1 水稻耐冷机理研究进展

1．2．2 水稻耐冷基因工程现状

1．2．3 植物抗逆miRNA的研究进展

1．2．4 miR156的研究进展

1．3 本研究的课题来源及研究内容

1．3．1 本研究的课题来源

1．3．2 本课题的研究内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 数据库及生物软件

2．1．3 菌株及质粒

2．1．4 试剂

2．1．5 培养基及营养液

2．1．6 仪器及耗材

2．2 试验方法

2．2．1 冷胁迫应答miRNA在水稻中的超量表达

2．2．2 mi156k超量表达植株的冷胁迫表型分析

2．2．3 水稻miR156k耐冷分子机制研究

3 结果与分析

3．1 水稻miR156k的过量表达

3．1．1 冷胁迫应答基因pre-miR156k植物表达载体的构建

3．1．2 水稻pre-miR156k转化水稻及抗性植株的获得

3．1．3 抗性植株的分子生物学检测

3．2 水稻miR156k耐冷功能分析

3．2．1 水稻miR156k转基因植株萌发期耐冷功能分析

3．2．2 水稻miR156k转基因植株幼苗期耐冷功能分析

3．3 水稻miR156k耐冷分子机制研究

3．3．1 转miR156k基因水稻生理指标测定

3．3．2 靶基因在冷胁迫处理下的表达分析

3．3．3 水稻miR156k调控低温胁迫Marker基因表达分析

4 讨论

4．1 目标miRNA的选择

4．2 miR156k基因功能分析方法

4．3 miR156k基因在冷胁迫应答反应过程中作用机制的探讨

4．4 研究展望

5 结论

5．1 超量表达miR156基因水稻的获得

5．2 冷敏感转miR156基因水稻的获得

5．3 转miR156基因水稻冷胁迫应答的分子机制

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文