莠去津矿化群落NC1的筛选、鉴定及个体特性的研究

摘要

莠去津又名阿特拉津，英文名:Atrazine，属于三嗪类除草剂，在过去的40年中已被广泛应用于农作物的杂草控制，如高粱、玉米和甘蔗。因为长期大范围使用目前已造成了严重的环境污染，在作物生长的土壤、水体中均已检测到莠去津存在，它不仅破坏生态环境，还严重危害着人类的健康。本论文的研究目的是筛选出污染土壤中的莠去津矿化群落，并进行分离鉴定。在国内外微生物矿化莠去津研究的基础上对这些矿化微生物的矿化特性进行较为系统的研究。
　　本研究利用富集培养法，从黑龙江省伊春市南岔区长期施用莠去津的玉米地中筛选出莠去津高效矿化群落NC1，此群落可以在28 h时矿化MSM培养基内99％的100 mg/L的莠去津，使其转变为无毒的氰尿酸。通过MSM平板直接分离法，分离出5株形态、颜色各不相同的菌株。通过生理生化和16S rDNA鉴定，菌株YJY1、YJY2、YJY3、YJY4和YJY5分别被鉴定为肠道杆菌(Enterobacter sp.)、无色杆菌(Achromobacter sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas sp.)、希瓦氏菌(Shewanella sp.)和克雷白氏肺炎菌(Klebsiella sp.)。并将上述五种菌株分别命名为Enterobacter sp.YJY1、Achromobacter sp.YJY2、Pseudomonas sp.YJY3、Shewanella sp.YJY4和Klebsiella sp.YJY5。底物利用实验及矿化实验表明菌株YJY4和YJY5可以以莠去津为唯一氮源生长，所有群落成员均不能利用氰尿酸为唯一氮源生长，且菌株YJY4矿化莠去津效率明显强于菌株YJY5，所以确定菌株YJY4为矿化菌落NC1的主要成员。菌株YJY4是第一个被发现可以矿化莠去津的希瓦氏菌(Shewanella sp.)，这表明它对莠去津污染的土壤环境的修复具有巨大潜力。
　　在此基础上，对YJY4降解菌的特性进行了研究。根据对已发表的莠去津矿化微生物基因序列设计引物，通过PCR技术对于菌株YJY4基因组进行扩增，在菌株YJY4中分别发现了莠去津矿化基因atzA、atzB和atzC基因，通过序列比对，发现扩增出的三种矿化基因与已发表的假单胞菌ADP和节杆菌TC1中的矿化基因相似性很高，达到了98％以上，这也证明了菌株YJY4可以将莠去津矿化成无毒无害的氰尿酸。利用定时培养，每隔4h测定OD600nm处吸光值观察菌株生长情况，证实菌株YJY4在近似中性的pH(6.0-8.0)范围内都可以很好生长，其最适碳源和氮源分别为蔗糖和硝酸铵。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 莠去津的基本特性及施用现状

1．1．1 莠去津的基本理化性质

1．1．2 莠去津的施用现状

1．2 莠去津对生态系统的影响

1．2．1 莠去津对水生生态系统的影响

1．2．2 莠去津在农业生态系统中的影响

1．2．3 莠去津对人类健康的影响

1．3 莠去津的微生物矿化

1．3．1 真菌矿化莠去津

1．3．2 藻类矿化莠去津

1．3．3 放线菌矿化莠去津

1．3．4 细菌矿化莠去津

1．3．5 混合菌株矿化莠去津

1．4 莠去津微生物矿化的途径以及相关矿化基因

1．5 莠去津微生物矿化存在的问题及研究趋势

1．6 研究的目的意义及内容

1．6．1 研究目的和意义

1．6．2 研究的内容

1．7 课题来源

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 试剂与仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器

2．3 主要培养基和配制方法

2．3．1 分离筛选培养基

2．3．2 纯培养培养基

2．4 莠去津及氰尿酸的测定方法

2．4．1 莠去津的提取及测定

2．4．2 氰尿酸的提取及测定

2．5 莠去津矿化群落NC1组成及矿化能力的研究

2．5．1 莠去津矿化群落NC1各成员形态和培养特征鉴定

2．5．2 莠去津矿化群落NC1基本矿化能力的的测定

2．5．3 莠去津矿化群落NC1各成员底物特异性的研究

2．5．4 莠去津矿化群落NC1各成员的生理生化鉴定

2．5．5 矿化群落NC1各成员的16S rDNA鉴定及进化树的构建

2．5．6 莠去津矿化群落NC1各成员生长关系曲线

2．6 群落NC1主要成员Shewanella sp．YJY4的生长及矿化特性

2．6．1 菌株Shewanella sp．YJY4中矿化基因的克隆

2．6．2 菌株Shewanella sp．YJY4生长及矿化特性的研究

2．6．3 碳源对菌株Shewanella sp．YJY4生长的影响

2．6．4 氮源对菌株Shewanella sp．YJY4生长的影响

2．6．5 不同pH值对菌株Shewanella sp．YJY4生长的影响

3 结果与讨论

3．1 莠去津矿化群落NC1组成及矿化能力的研究

3．1．1 莠去津矿化群落NC1矿化莠去津的能力

3．1．2 莠去津矿化群落NC1组成成员的鉴定

3．1．3 矿化群落NC1及组成成员对去津和氰尿酸的利用能力

3．1．4 莠去津矿化群落NC1及组成成员生长能力

3．2 群落NC1主要成员Shewanella sp．YJY4的生长及矿化特性的研究

3．2．1 菌株YJY4生长及矿化特性的研究

3．2．2 菌株YJY4中矿化基因的克隆

3．3 不同因素对菌株YJY4生长的影响

3．3．1 菌株YJY4对不同碳源的利用情况

3．3．2 菌株YJY4对不同氮源的利用情况

3．3．3 不同pH对菌株YJY4生长的影响

4 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文