大白菜现蕾前叶色转变过程中蛋白组学分析及BrTUAs鉴定

摘要

大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis(Lour) Olsson)起源于我国，是十字花科芸薹属中重要的蔬菜作物之一，是我国各类蔬菜中栽培面积最大，栽培历史悠久的一种蔬菜作物。大白菜因其具有产量高、生产成本低、种植方法简单、耐贮运强，是我国北方城乡人民的“当家菜”，在菜篮子工程中具有重要的地位。
　　近年来，大白菜反季节栽培生产发展迅速，春季大白菜的种植面积不断扩大，但由于栽培管理不当及气候因素的影响，常有先期抽薹现象的发生。先期抽薹是指叶球尚未充分形成之前发生的抽薹现象，叶球失去商品价值和食用价值，导致大幅度减产绝收，给生产造成重大损失。在我国春季及高海拔地区的夏白菜生产中，先期抽薹常常成为困扰生产的一道难题。同时，在种子生产、加代繁殖过程中，经常遇到不抽薹或花期延后现象，严重影响种子产量和质量。因此研究大白菜开花的分子遗传机理，尤其是研究抽薹相关基因调控，对于大白菜良种繁育和合理栽培调控具有重要意义。
　　我们在育种实践中发现，大白菜在花芽分化后、抽薹前表现出一个叶色转变过程，叶片颜色从鲜亮的绿色转为没有光泽的暗灰色后花茎就会伸长、抽薹，叶色转变似乎是大白菜抽薹的一个生理信号。前期分析了激素、色素含量变化与叶色转变的关系及叶色转变过程中AP1、LEFY、FT等基因的表达变化。本试验力图在已有的基础上，通过叶色转变过程蛋白质组学分析，并对相关基因表达进行进一步的鉴定，加深对大白菜发育分子生物学机制的认识，以期为大白菜抽薹开花分子调控提供更多的理论依据。本试验取得如下结论:
　　(1)试验以C30自交系为试验材料，利用双向电泳技术比较大白菜叶色转变前后植株生长点部位蛋白组分变化，发现叶色转变前后特异表达蛋白点35个，差异表达蛋白点32个。对17个边界清晰、表达量较高的蛋白点进行MALDI-TOF/MS质谱技术分析，鉴定出4个有信息价值的差异蛋白点，分别为V型H+转运ATP酶E1亚基、Rubisco的大亚基、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和微管蛋白α-2。
　　(2)用目标蛋白推测的核苷酸序列在大白菜基因组数据库blast分析后设计特异引物，荧光定量PCR分析表明BrVHA-E1、BrSAMS、BrrbcL和BrTUA6在大白菜叶色转变前后表达发生明显变化，并与蛋白组学分析结果一致，可能参与了抽薹调控和发育。
　　(3)以拟南芥6个TUA基因氨基酸序列作为查询种子序列，在大白菜基因组数据库中在线运行Blastp，共发现12个BrTUA。通过对12个BrTUA基因结构、进化和功能预测，发现BrTUA基因长度、内含子、外显子和启动子区域伴随基因组进化发生了较大变化;12个BrTUA中仅有5个编码完整的α-微管蛋白。
　　(4) TUA系统发育分析，表明BrTUA与AtTUA、Bn TUA亲缘关系较近，TUA的进化与物种进化同步。
　　(5)通过对5个编码完整的α-微管蛋白的BrTUA启动子区域顺式作用元件分析，在起始密码子上游1.5 kb区域，共发现27种类型、超过60个顺式作用元件。BrTUA启动子区域有大量光周期反应元件;不同BrTUA中低温反应原件、激素反应相关元件差异较大;5个BrTUA启动子区域都有一个或多个组织特异性表达元件。推测不同的α-tubulin在大白菜生长发育调控中扮演者不同角色。
　　(6)5个编码完整的α-微管蛋白的BrTUA呈现出时空表达的差异;尤其在春化前后、现蕾前的叶色转变过程中，BrTUA表达差异较大，说明BrTUA参与了大白菜抽薹开花调控。
　　(7)通过叶色转变前施用外源物质对大白菜抽薹开花的影响及BrTUA表达分析，确定春化后、叶色转变前，向大白菜生长点喷施微管敏感药物紫杉醇及GA3和MJ，可调控BrTUA表达并实现对抽薹开花的调控。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究的目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 十字花科植物开花的环境调控和生理机制

1．2．2 调控植物开花的遗传途经

1．2．3 MADS-box基因在植物开花调控的作用

1．2．4 FLOWERING LOCUS T(FT)

1．2．5 表观遗传与植物开花

1．2．6 蛋白质与植物成花

1．2．7 微管与植物发育

1．3 研究内容

1．4 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验材料

2．1．2 主要分子生物学及化学试剂

2．1．3 主要试验仪器

2．1．4 主要软件及数据库

2．2 试验方法

2．2．1 转色前后蛋白组学分析

2．2．2 差异蛋白基因转色前后表达分析

2．2．3 BrTUAs结构与功能预测分析

2．2．4 BrTUAs时空表达分析

2．2．5 茎尖细胞微管重排与花茎伸长关系分析

2．2．6 外源物质对TUA表达和花茎伸长的影响

3 结果与分析

3．1 转色前后蛋白组学分析

3．1．1 蛋白表达变化的双向电泳图谱分析

3．1．2 质谱分析及蛋白质检索

3．1．3 差异表达蛋白功能分析

3．1．4 四个差异蛋白基因搜索比对结果

3．2 四个差异蛋白的基因表达分析

3．2．1 总RNA的提取与检测

3．2．2 熔解曲线建立

3．2．3 四个差异蛋白的基因表达分析

3．3 BrTUAs结构与功能预测分析

3．3．1 BrTUAs鉴定

3．3．2 BrTUAs结构分析

3．3．3 BrTUAs染色体定位

3．3．4 BrTUAs进化分析

3．3．5 BrTUAs分子功能预测

3．3．6 BrTUAs启动子分析

3．3．7 BrTUAs表达模式预测

3．4 BrTUAs时空表达分析

3．4．1 总RNA的提取与检测

3．4．2 BrTUAs在不同组织中的表达分析

3．4．3 BrTUAs在抽薹过程表达分析

3．5 茎尖细胞微管重排与花茎伸长关系分析

3．6 外源物质对BrTUAs表达和花茎伸长的影响

3．6．1 外源物质对花茎伸长的影响

3．6．2 外源物质对BrTUAs表达的影响

4 讨论

4．1 现蕾前叶色转变过程中蛋白组份变化

4．2 BrSAMS、BrrbcL和BrVHA-E1在大白菜抽薹开花的作用

4．3 BrTUAS的进化分析

4．4 BrTUAs参与抽薹调控

4．4．1 BrTUA的启动子区域的顺式作用元件与大白菜抽薹开花

4．4．2 BrTUAs表达模式预测与BrTUA表达分析

4．4．3 BrTUAs参与抽薹调控

4．4．4 外源物质对BrTUA表达及抽薹的影响

4．5 论文创新点

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文