一种鉴定白菜A09染色体上的抗病毒病QTL—BrTuA09的分子标记及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定白菜病毒病TuMV-C4小种抗性的、定位于A09染色体的SNP分子标记及其应用。本发明的SNP分子标记由序列2所示的单链DNA分子、序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成。通过对92个单株组成的BC1群体对分子标记的验证结果显示：该SNP分子标记的选择准确率在85％以上，可用于分子标记辅助育种，并为进一步定位和克隆基因奠定了良好的基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定白菜A09染色体上的抗病毒病QTL —BrTuA09的分子标记及其应用，可用于病毒病TuMV-C4小种的抗性鉴定。

背景技术

大白菜(BrassicarapaL.ssp.Pekinensis)是我国重要的经济作物之一，病毒病严 重威胁大白菜的产量和质量，平均每年可造成5％～10％的产量损失，流行年份发病率 可达80％，甚至绝收。目前尚无有效药剂及控制技术，培育抗病品种成为最有效的防 治措施。随着分子生物学和生物信息学的不断发展，发掘与分离不同来源的抗性主效 QTL，并通过分子设计育种进行高效聚合，选育稳定、持久抗病品种，成为保证大白 菜安全无污染生产的有效途径之一。

病毒病对多种芸薹属作物危害严重，挖掘与抗性基因或QTL连锁的分子标记在加 速分子标记辅助育种方面极为重要。在国外Rusholme以DH群体为材料定位到两个 QTL，位于A6连锁群的TuRB01b和位于R4连锁群的retr01；Fujiwara(2011)将Rnt1 定位在A6连锁群上；近期Jin(2014)在A6连锁群上定位了一个抗TuMV-C4的 QTL-TuRB07，并获得候选基因。国内屈淑平(2008)在大白菜上检测到4个抗TuMV-C3 的QTL位点；韩和平(2004)发现了一个与TuMV-C5抗性相关的显性标记；张俊华 等(2008)报道了4个抗TuMV-C3的QTL；张晓伟等(2009)发现3个抗TuMV-C4 的QTL位点；Zhang(2008)通过研究，在一张包含376个分子标记的遗传图谱上， 发现了4个与大白菜抗TuMV-C4相关的QTL。

研究表明分子标记在目标资源筛选，定位调控特定农艺性状的基因、基因聚合和 品种鉴定等方面的应用越来越广泛。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易 实现自动化等特点。基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型 检测是英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist)有限公司开发的高通量SNP 分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点。该方案的核心是KASP技术， 即CompetitiveAllele-SpecificPCR。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP 分型以及检测InDels(InsertionsandDeletions，插入和缺失)，目前已经成为国际上SNP 分析的主流方法之一。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病 TuMV-C4小种抗性的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TuMV-C4小种抗性的方法 是检测待测白菜的基因型是CC基因型还是TT基因型还是TC基因型，根据所述白菜 的基因型确定所述白菜品种对病毒病TuMV-C4小种的抗性：TT基因型的白菜品种对 病毒病TuMV-C4小种的抗性为感病，TC基因型的白菜品种和CC基因型的白菜品种 对病毒病TuMV-C4小种的抗性为抗病；

所述CC基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸为C的纯合体；

所述TT基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸为T的纯合体；

所述TC基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸为C和T的杂合体。

上述方法中，所述检测待测白菜的基因型是CC基因型还是TC基因型的方法为 如下A)或B)：

A)直接测序白菜的基因组DNA；

B)测序含有白菜A09染色体上第9805885位脱氧核糖核苷酸的PCR扩增产物；

所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子、序列表中序列3所示的单链DNA 分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的成套引物A；

2)由序列A所示的单链DNA分子、序列B所示的单链DNA分子和序列C所示 的单链DNA分子组成的成套引物B；

所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相 同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相 同功能的核苷酸；

所述序列C为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相 同功能的核苷酸。

上述方法中，病情指数在0-33.33范围内的白菜品种对病毒病TuMV-C4小种的抗 性为抗病；病情指数在33.34-100范围内的白菜品种对病毒病TuMV-C4小种的抗性为 感病。

本发明的第二个目的是提供检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷 酸的物质的新用途。

本发明提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷酸的物质在鉴 定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TuMV-C4小种抗性中的应用。

本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷酸的物质在 制备鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TuMV-C4小种抗性的产品中的应用。

本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷酸的物质在 白菜育种中的应用。

本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷酸的物质在 制备白菜育种的产品中的应用。

本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷酸的物质在 选育抗病毒病TuMV-C4小种的白菜中的应用。

本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷酸的物质在 制备选育抗病毒病TuMV-C4小种的白菜的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病 TuMV-C4小种抗性的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TuMV-C4小种抗性的产品 为检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷酸的物质。

上述应用或上述产品中，

所述检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核苷酸的物质为如下1)或 2)或3)或4)：

1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子、序列表中序列3所示的单链DNA 分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的成套引物A；

2)由序列A所示的单链DNA分子、序列B所示的单链DNA分子和序列C所示 的单链DNA分子组成的成套引物B；

所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相 同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相 同功能的核苷酸；

所述序列C为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相 同功能的核苷酸；

3)含有1)所述的成套引物A或2)所述的成套引物B的PCR试剂；

4)含有1)所述的成套引物A或2)所述的成套引物B或3)所述的PCR试剂的 试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种选育抗病毒病TuMV-C4小种的白菜品种的方法。

本发明提供的选育抗病毒病TuMV-C4小种的白菜品种的方法包括选择TC基因型 的白菜品种或CC基因型的白菜品种进行育种；

所述TT基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸为T的纯合体；

所述TC基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸为C和T的杂合体。

上述方法或上述应用或上述产品中，所述白菜为带有抗病毒病QTL—BrTuA09的 白菜；所述带有抗病毒病QTL—BrTuA09的白菜为带有抗病毒病QTL—BrTuA09的大 白菜。

本发明根据双亲基因组重测序信息，于目标QTL-BrTuA09所在区间进一步开发 出1个与病毒病抗性紧密连锁的SNP标记，该分子标记可用于对白菜品种的病毒病 TuMV-C4小种的抗性鉴定。通过92个单株组成的BC1群体的验证显示：该标记的选 择准确率均在93％以上，可用于分子标记辅助育种，并为进一步定位和克隆基因奠定 了良好的基础。

附图说明

图1为Tu-A099805885T/C对92个单株组成的BC1群体验证分型效果如图1所 示。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的0.05M(PH＝7.0)磷酸缓冲液配制方法：分别量取61.0mL的0.2 mol/LNa₂HPO₄母液和39.0mL的0.2mol/LNaH₂PO₄母液，混匀后定容至200mL，即 为0.05M(PH＝7.0)磷酸缓冲液。其中，0.2mol/LNa₂HPO₄母液的制备方法： Na₂HPO₄·2H₂O35.61g、Na₂HPO₄·7H₂O53.65g或Na₂HPO₄·12H₂O71.64g，用蒸馏水溶 解并定容至1000mL；0.2mol/LNaH₂PO₄母液的制备方法：NaH₂PO₄·H₂O27.6g或 NaH₂PO₄·2H₂O31.2g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。

下述实施例中的父本91-112为连续自交9代的大白菜高代自交系，高抗TuMV-C4； 母本T12-19是双单倍体株系，高感TuMV-C4。父本91-112和母本T12-19均在文献 “GeneticmappingandlocalizationofamajorQTLforseedlingresistancetodownymildew inChinesecabbage(Brassicarapassp.pekinensis，MolBreeding(2009)23:573–590”中公 开过，公众可从北京农林科学院蔬菜研究中心获得。

下述实施例中的病毒病TuMV-C4小种在文献“田喜辉等，一个新的白菜苗期 TuMV-C4抗性主效QTL定位及连锁分子标记开发，《华北农学报》，2014(06):1-5”中 公开过，公众可从北京农林科学院蔬菜研究中心获得。

实施例1、分子标记的获得

以来源于T12-19×91-112的100个株系组成的DH群体为作图群体，进行了分子 遗传图谱的构建研究。最终在A09上检测到一个QTL位点QTL-BrTuA09，LOD值为 18.6，加性效应为16.2％，可解释的表型变异达62.0％，该位点是一个新发现的主效 QTL位点。上述研究结果参见文献“田喜辉等，一个新的白菜苗期TuMV-C4抗性主 效QTL定位及连锁分子标记开发《华北农学报》，2014(06):1-5”。

QTL位点QTL-BrTuA09位于标记Fito518与标记MR172之间，利用重测序信息 在该区间进一步筛选并设计SNP标记，最终获得了1个多态性SNP标记，命名为 Tu-A099805885T/C。Tu-A099805885T/C标记由上游引物A099805885-FF、上游引物 A099805885-FV和下游引物A099805885-R组成。A099805885-FF、A099805885-FV 和A099805885-R引物委托英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist，政府化 学家实验室)有限公司获得，引物序列如下：

上游引物A099805885-FF： GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTCTGGTGAACTACAGTTCCCTTCc(序列2)；

上游引物A099805885-FV： GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTCTGGTGAACTACAGTTCCCTTCt(序列3)；

下游引物A099805885-R：CAAACCACTCCCGAATAGATACAGG(序列4)。

上述上游引物最后一位碱基c/t对应序列1的第300位，也即大白菜(Brassicarapa pekinensis)A09染色体上第9805885位的SNP位点。大白菜Brassicarapapekinensis的 参考全基因组序列的版本号为V1.5(下载地址http://brassicadb.org/brad)。

实施例2、分子标记在鉴定白菜A09染色体上的抗病毒病TuMV-C4小种抗性中 的应用

一、TuMV-C4小种的抗性鉴定

1、BC₁群体的获得

以抗病亲本91-112为父本、感病亲本T12-19为母本进行杂交，得到杂交一代(F₁代)，再将F₁代与母本T12-19进行一次回交，得到92个单株组成的BC₁群体。

2、接种及病情调查及分级标准

对步骤1获得的92个BC1单株、抗病亲本91-112、感病亲本T12-19和杂交一代 F1进行接种病毒病TuMV-C4小种，鉴定92个BC1单株的病毒病TuMV-C4小种抗性。 具体步骤如下：

将92个BC1单株、抗病亲本91-112、感病亲本T12-19和杂交一代F1的种子， 催芽后播种于8cm营养钵中，所用土壤和草炭为经过高温高压灭菌后按1:1比例混合 得到。待实验材料的幼苗第三片真叶充分展开后进行人工接种。接种时，先在被鉴定 材料上喷300～400目的石英砂，然后用手指蘸取病毒病TuMV-C4小种的病汁液分别 对两片真叶摩擦接种，接种后立即用蒸馏水将叶片冲洗干净，遮阴培养24小时。在第 一次接种后的第三天再重复接种一次，白天温度控制在25℃～28℃，夜间温度20℃～ 22℃，在温室中培养25～28天后，进行TuMV抗性鉴定。在接种后28天，调查每一 株苗子的病害程度，记录病级，再换算成病情指数，最后进行抗性分析。病级的分级 标准是按病害症状的轻重分为0、1、3、5、7、9级。病情指数＝∑(病级的代表值× 该病发病株数)/调查总株数×9(划分级别的最高级代表值)×100。病情指数在0-33.33 范围内的BC1单株对病毒病TuMV-C4小种的抗性为抗病；病情指数在33.34-100范围 内的BC1单株对病毒病TuMV-C4小种的抗性为感病。

病级的分级标准如下：

0级：无任何症状；

1级：少数叶片有褪绿斑，或少数叶片轻微花叶；

3级：多数叶片至全株表现轻花叶，或少数叶片有蚀纹斑；

5级：全株重花叶，株型明显矮小或叶柄局部坏死，少数叶片畸形；

7级：全株严重花叶，伴有枯斑，部分叶片枯死:或全株叶片皱缩畸形，植株矮化；

9级：大部分叶片枯死以致整株死亡。

抗病性评价标准如下：

免疫I：病情指数＝0；

高抗HR：病情指数0.01～11.11；

抗病R：病情指数11.12～33.33；

耐病T：病情指数33.34～55.55；

感病S：病情指数55.56～77.77；

高感HS：病情指数77.78～100。

表型检测结果表明：92个BC1单株中，44个BC1单株、亲本91-112和杂交一代 F1均鉴定为抗病，48个BC1单株和亲本T12-19均鉴定为感病。

二、基因型与抗病毒病TuMV-C4小种抗性的关联性分析

1、基因组DNA的提取

分别提取步骤一中获得的92个BC1单株、抗病亲本91-112和感病亲本T12-19 的基因组DNA，提取方法可采用常规CTAB法或快速高通量提取植物基因组DNA的 方法。本发明采用常规CTAB法提取基因组DNA。具体步骤如下：

将每个样本的叶片样品装入2mL离心管中，加入1粒0.4mm的钢珠后写清编号， 放入液氮中冷冻5-10min，再使用组织研磨机打碎。每管加入800μL65℃预热的CTAB 缓冲液，迅速振荡混匀，放入65℃水浴锅水浴30min，期间至少颠倒混匀一次。再向 离心管中加入800μL氯仿/异戊醇(氯仿：异戊醇为24：1)，振荡混匀，静止5min后， 12000r/min离心10min。吸600μL上清液转入另一只2mL离心管中，加入等体积-20℃ 预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀，放于-20℃冰箱冷却20min，然后10000r/min离心5min， 弃上清。用800μL75％乙醇漂洗2次，每次10000r/min离心5min，弃上清液收集沉淀， 最后室温下吹干沉淀，加入50μLddH₂O溶解DNA。

通过1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对提取得到的基因组DNA的质量进行 检测，合格的DNA要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100 检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0 之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。 根据英国LGC公司的KASP检测技术和白菜基因组大小换算出DNA用量为4～10ng/ 每样品，稀释DNA浓度成为4～10ng/μl，备用。

2、引物预混液的配制

将实施例1中的上游引物A099805885-FF、上游引物A099805885-FV和下游引物 A099805885-R均稀释成10μmol，并按照体积比为6:6:15的比例混匀，得到引物预混 液。

3、基因分型

基于实施例1中的SNP位点(A09染色体上第9805885位)利用KASP技术对步 骤1中的92个BC1单株、父本91-112和母本T12-19进行SNP基因分型，SNP基因 分型过程按照LGC公司提供的KASP技术的实验流程进行，以下使用的试剂、耗材和 仪器没有特殊说明的均由LGC公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按 照LGC公司的操作指南KASPuserguideandmanual(www.lgcgenomics.com)进行， 反应在384孔板(PartNo.KBS-0750-001)或1536微孔板(PartNo.KBS-0751-001) 中进行，反应体系为3ul或1ul。具体步骤如下：

首先利用K-pette分液工作站将步骤1稀释好的待测DNA模板(4～10ng/μl)1.5ul 和空白对照(Notemplatecontrol,NTC)分别加入384孔或者1536孔反应板中，60℃ 烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作系统下利 用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Mastermix(384孔板货号Part No.KBS-1016-002或1536微孔板货号PartNo.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分 装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用 Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。反应体系如表1所示。

表1、384孔板或1536孔板的反应体系

注：Meridian在分液过程中为排气泡每加1对引物时需损失230μl的反应液，即 2xMastermix和ddH₂O各115μl。

PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15 分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touchdown程序 扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26 个循环。扩增结束后，利用BMGPHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若 分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全，从Kraken软件 中导出实验结果。

Tu-A099805885T/C对92份BC1单株的分型效果图如图1所示，图中每个圆点代 表一份待测材料，其中红色圆点表示该位点是纯合基因型“TT”；蓝色圆点表示该位点 是纯合基因型“CC”；绿色圆点表示该位点是杂合基因型“TC”；黑色圆点表示NTC， 即为水对照。其中抗性亲本91-112在该位点的基因型是CC基因型，感病亲本T12-19 在该位点的基因型是TT基因型。92个BC1单株中，41个BC1单株鉴定为TC基因 型，50个BC1单株鉴定为TT基因型，1个BC1单株未能分型。分型成功率为99％， 说明Tu-A099805885T/C分型效果良好，Tu-A099805885T/C标记能特异区分该位点 为纯合CC基因型、纯合TT基因型还是杂合TC基因型。

4、基因型和感抗病的关联分析

92个BC1单株基因型和感抗病的关联分析结果如表2所示：表型为抗病的44个 单株中，鉴定基因型为TC的有41株，基因型为CC的有3株，所以选择准确率为93％； 表型为感病的48个单株中，鉴定基因型为TT的有46株，基因型为TC的有1株，未 获得基因型的有1株，所以选择准确率为95.8％；因此该标记选择的综合准确率为 94.6％。

表2、基因型和感抗病的关联分析结果

综上所述，可以通过确定白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸来确定待测白 菜为CC基因型还是TT基因型还是TC基因型，从而辅助鉴定待测白菜品种对病毒病 TuMV-C4小种抗性：TT基因型的白菜品种对病毒病TuMV-C4小种的抗性为感病，TC 基因型的白菜品种和CC基因型的白菜品种对病毒病TuMV-C4小种的抗性为抗病；

CC基因型为大白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸为C的纯合体；

TT基因型为大白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸为T的纯合体；

TC基因型为大白菜A09染色体上第9805885位的核苷酸为T和C的杂合体。