硒缺乏对鸡免疫器官损伤机制的研究

摘要

营养微量元素硒是各种生命体正常免疫功能的重要组分之一。硒蛋白和硒在免疫系统中扮演重要角色。硒在鸡免疫系统中是非常重要的，它是通过硒蛋白的形式发挥其生理功能。细胞因子是一类是由种类广泛的造血和非造血细胞产生的可溶性低分子量的多肽，对细胞的增值、分化、激活和运动具有抑制或提升作用。热休克蛋白具有保守性，几乎存在于所有物种体内，并热休克蛋白通常被作为在各种应激条件动物（包括禽类）的生物学标记。自噬是一个在特定细胞和系统中对标靶组分发挥影响的过程。哺乳动物体内的硒蛋白、细胞因子、热休克蛋白、自噬相关基因以及免疫系统的超微结构对日粮的硒水平是十分敏感的;但是，人们对于鸡脾脏、法氏囊及胸腺中硒蛋白和热休克蛋白的mRNA表达量、热休克蛋白的蛋白水平、自噬相关基因的mRNA和蛋白水平以及硒缺乏对细胞因子、免疫器官的内部结构的影响知之甚少。本试验中，我们测定了硒蛋白Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Dio1、Dio2、Dio3、GPx1、GPx2、GPx3、Gpx4、Sepp1、Selo、Sep15、Sepx1、Sels、Seli、Selu、Selh和SPS2的mRNA表达量，热休克蛋白Hsp27、Hsp40、Hsp60、Hsp70和Hsp90的mRNA表达量、Hsp40、Hsp60、Hsp70和Hsp90的蛋白水平，自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、Dynein、ATG5、TOR1的mRNA表达量、LC3-Ⅱ、Beclin1、Dynein的蛋白水平，细胞因子IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-1β、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α的含量，以及鸡胸腺、脾脏、法氏囊结构损伤变化。试验动物被随机分为2组:缺硒组饲喂含硒量为0.033mg/Kg的日粮，对照组饲喂添加硒至0.15mg/Kg的日粮。实时定量PCR用于检测15、25、35、45和55日龄鸡的硒蛋白、热休克蛋白、自噬相关基因的表达水平，并于35、45、55日龄鸡热休克蛋白、自噬相关基因的蛋白水平是通过western blot技术检测分析的，ELISA用于评定细胞因子在15、35、55日龄的含量，另外利用电镜观察鸡免疫器官的超微结构变化。
　　结果显示，与对照组相比，缺硒组鸡胸腺、脾脏、法氏囊中的硒蛋白Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Dio1、Dio2、Dio3、GPx1、GPx2、GPx3、Gpx4、Sepp1、Selo、Sep15、Sepx1、Sels、Seli、Selu、Selh和SPS2的mRNA水平均显著降低。
　　细胞因子的研究表明在缺硒组胸腺中IL-2、IL-6、IL-17、IL-1β、IFN-α的水平显著降低，而IL-8、IL-10、IFN-β、IFN-γ和TNF-α的含量显著升高。在缺硒组法氏囊中IL-2、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-17、IL-1β、IFN-α、IFN-β、IFN-γ显著减少，而TNF-α显著增加。在缺硒组胸腺中可观察到IL-2、IL-10、IL-17、IL-1β、IFN-α、IFN-β的水平显著降低，而IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α的水平显著升高。
　　热休克蛋白mRNA水平的结果显示缺硒组胸腺、脾脏、法氏囊中5种热休克蛋白（Hsp27、Hsp40、Hsp60、Hsp70和Hsp90）均显著增加。热休克蛋白的蛋白水平结果与其mRNA水平结果一致。
　　自噬相关基因表达量的结果表明，与对照组相比，缺硒组脾脏中LC3-Ⅰ、IL3-Ⅱ。Beclin1、Dynein、ATG5、TOR1的mRNA水平和LC3-Ⅱ、Beclin1、Dynein的蛋白水平更高;缺硒组法氏囊中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、Dynein、ATG5、TOR1的mRNA水平，Beclin1和Dynein的蛋白水平增加而LC3-Ⅱ的蛋白水平降低;缺硒组胸腺中LC3-Ⅰ、Beclin1和AGT5的mRNA水平升高，LC3-Ⅱ、Dynein、TOR1的mRNA水平下降，Beclin1的蛋白水平升高而LC3-Ⅱ和Dynein的蛋白水平明显下降。可在缺硒组胸腺、脾脏、法氏囊中观察到进一步的细胞形态学变化，如自噬泡、自噬性溶酶体以及溶酶体降解。
　　总而言之，缺硒导致硒蛋白表达量的显著降低以及细胞因子和自噬相关基因的变化。超微结构的变化也进一步验证了硒缺乏时，免疫器官（脾脏、胸腺、法氏囊）发生了一定程度的损伤。我们的结果为缺硒对鸡免疫器官影响的研究增添了数据资料。

目录

声明

摘要

Abstract

1．Introduction

1．1 Effect of Se on immune organs

1．2 Selenoprotein function and expression

1．3 Cytokines function and expression

1．4 Hsps function and expression

1．5 Autophagy function and expression

1．6 Objectives of Research

2．Materials and Methods

2．1 Chicken Diet

2．2 Determination of mRNAs levels by Quantitative Real-Time PCR

2．3 Western blot analysis

2．4 Determination of Immune Function

2．5 Determination of Ultra structure

2．6 Statistical Analysis

3．Resuits

3．1 Result of selenoproteins mRNA level in chicken spleen

3．2 Result of selenoproteins mRNA level in chicken bursa of Faricius

3．3 Result of selenoproteins mRNA level in chicken thymus

3．4 Result of cytokines in chicken spleen

3．5 Result of cytokines in chicken bursa of Fabricius

3．6 Result of cytokines in chicken thymus

3．7 Result of Hsp mRNA levels in chicken spleen

3．8 Result of Hsps mRNA levels in the chicken bursa of Fabricius

3．9 Result of Hsp mRNA levels in chicken thymus

3．10 Result of Hsps protein levels in chicken spleen

3．11 Result of lisps protein levels in the chicken bursa of Fabricius

3．12 Result of Hsps protein levels in chicken thymus

3．13 Result of autophagy genes mRNA levels in chicken spleen

3．14 Result of autophagy genes mRNA levels in chicken bursa of Fabricius

3．15 Effect of Se deficiency on autophagy genes mRNA levels in chicken thymus

3．16 Result of autophagy genes protein level in chicken spleen

3．17 Result of autophagy genes protein level in chicken bursa of Fabriciu

3．18 Result of autophagy genes protein level in chicken thymus

3．19 Result of ultrastrcuture expression in spleen，bursa of Fabricious and thymus of chicken

4．Discussion

4．1 Effect of dietary Se on selenoproteins mRNA level in chicken immune organs

4．2 Effect of dietary Se on cytokines expression level in chicken immune organs

4．3 Effect of dietary Se on Hsps expression level in chicken immune organs

4．4 Effect of dietary Se on autophagy related genes level in chicken immune organs

4．5 Effect of dietary Se on ultrastructure of immune organs of chicken

5．Conclusions

Acknowledgements

References

List of Abbreviation

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