鸡大肠埃希氏菌iss基因与其致病力相关性的研究

摘要

大肠埃希氏菌（又名大肠杆菌）是自然环境中的常在菌，亦是温血动物消化道下段的常住菌，属革兰氏阴性中等大小的杆菌。研究表明，某些血清型的大肠杆菌为致病菌，某些血清型的大肠杆菌不致病，是动物肠道的益生菌，而另一些大肠杆菌为条件致病菌，在一般情况下不致病，但在饲养环境卫生条件差、动物应激、免疫力低下等情况下会造成发病。
　　有研究表明，大肠杆菌iss基因(increased serum resistance gene)的存在与否是判定大肠杆菌致病性的重要手段之一。但亦有实验表明，大肠杆菌iss基因几乎存在于所有大肠杆菌中，因此，深入研究大肠杆菌iss基因与其致病力的关系对科学防治本病具有重要的指导意义。
　　本研究对72株鸡源大肠杆菌iss基因分别通过外套PCR、内套PCR和实时荧光定量PCR进行了检测，检测结果表明，利用外套PCR和内套PCR检测到69株菌具有iss基因，3株未检测出iss基因，但实时荧光定量PCR检测该3株菌均有iss基因的存在，实验结果表明，iss基因在大肠杆菌中普遍存在，但其转录水平的高低因不同的菌株有所差异。
　　将69株大肠杆菌iss基因序列进行测序，与其他19株大肠杆菌序列一起进行比对，共有16种不同的核苷酸序列，10种氨基酸序列，分别命名为type1-16和form1-10。经过比对发现，不同序列之间的差异很小，突变的位置较为固定，但多数氨基酸序列并未发生改变，表明该基因保守性很高。进化树分析结果显示，16种核苷酸序列的进化树分为2个主干，其中type15序列菌株和type16序列菌株位于同一分支，type1-14序列菌株位于同一大分支。氨基酸序列分析结果显示，进化树主要分为2个大分支，其中form3、5序列菌株位于同一分支，其他序列菌株位于另一分支。
　　随机选取30株大肠杆菌分别接种雏鸡进行了致病性试验，并进行了实时荧光定量PCR检测30株大肠杆菌iss基因的转录水平，检测结果显示，菌株相对拷贝数的对数与其毒力成正相关。
　　分析发现，相对拷贝数的对数、毒力及血清抗性三者两两之间存在正相关关系，相对拷贝数的对数和雏鸡致死试验结果的相关性系数为0.769，p=0.000＜0.01，极显著正相关;相对拷贝数的对数与流式细胞术结果的相关性系数为0.662，p=0.000＜0.01，极显著正相关;流式细胞术结果与雏鸡致死结果的相关性系数为0.456，p=0.011＜0.05，显著正相关。这说明iss基因的转录水平越高，大肠杆菌对于血清的抵抗能力越强，致病力越强。
　　本研究结果显示，iss基因在大肠杆菌中是广泛存在的，与大肠杆菌致病力存在相关性，即iss基因转录水平越高，菌株毒力越强，且与血清抗性成正相关。通过本课题的研究，为大肠杆菌其他毒力基因的研究提供了借鉴，并为大肠杆菌致病性相关因素的深入研究提供了实验数据和理论基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 大肠杆菌的主要生物学特性

1．2 鸡大肠杆菌病概述

1．3 大肠杆菌的致病性因素

1．3．1 菌毛

1．3．2 铁转运系统

1．3．3 温敏性血凝素

1．3．4 毒素

1．3．5 外膜蛋白

1．3．6 血清抗性

1．4 大肠杆菌iss基因研究进展

1．5 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 实验动物

2．1．3 引物及序列合成

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 大肠杆菌的分离鉴定

2．2．2 套式PCR检测

2．2．3 致病力检测

2．2．4 iss基因转录水平检测

2．2．5 血清抗性检测

3 结果与分析

3．1 大肠杆菌分离鉴定结果

3．2 套式PCR检测iss基因结果

3．3 序列比对及进化分析结果

3．3．1 大肠杆菌按序列分组结果

3．3．2 iss基因进化分析结果

3．3．3 iss基因序列比对及同源性分析结果

3．4 致病力检测结果

3．5 iss基因转录水平检测结果

3．5．1 iss基因标准曲线结果

3．5．2 GAPDH基因标准曲线结果

3．5．3 实时荧光定量PCR结果

3．6 血清抗性检测结果

4 讨论

4．1 大肠杆菌iss基因在不同菌株中存在的普遍性

4．2 iss基因与大肠杆菌致病力相关性分析

4．3 血清抗性与大肠杆菌致病性相关性的分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文