黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH的克隆及遗传转化

摘要

黄瓜是一种极其重要的鲜食性蔬菜，广泛被人们所喜爱。但是近年来栽培技术不断更新、进步，蔬菜的生育期逐渐缩短，且生态环境的破坏导致蔬菜病虫害逐年加剧，病虫的抗药性也越来越强，所以绝大部分的蔬菜需要多次喷洒农药以后才能成熟上市，而农药的药性和持久性也随之越来越强，黄瓜农药残留问题日益严重，成为政府、市场和消费者广为关注的热点问题，而且它不仅严重危害到人的健康，也会影响到出口创汇[1]。
　　黄瓜霜霉病是黄瓜植株的主要病害之一，在各种地域及栽培设施中均能发生[2-8]，霜霉威属于氨基甲酸酯类杀菌剂，内吸性较强，我国有近80％的农民使用霜霉威来防治黄瓜霜霉病。因生产上的大规模、大剂量使用，霜霉威农药残留已经成为黄瓜生产上的一个不容忽视的问题。
　　琥珀酸脱氢酶(SDH)是将有机物氧化分解成CO2和H2O及ATP合成过程中的关键酶之一。它能够催化三羧酸循环(TCA)过程中的琥珀酸氧化生成延胡索酸。延胡索酸作为一种抗氧化剂，拥有捕获并中和自由基的功能，从而达到祛除自由基，降低对生物体的损害的作用。SDH的另一个重要功能是通过电子呼吸链产生ATP，为生物体各种生命活动提供能量，因此SDH的活性对生命体的整个生物代谢过程都有很大的影响。本课题组前期通过Solexa技术和比较基因组学的方法对霜霉威胁迫下黄瓜果实差异表达基因进行鉴定，筛选出黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH。
　　本研究利用PCR克隆获得SDH基因全长，并命名为CsSDH。构建亚细胞定位表达载体，并利用农杆菌浸润法注射烟草叶片后激光共聚焦显微镜下观察;分别用荧光定量RT-PCR方法和酶联免疫法研究高、低农残品系D9320和D0351中的CsSDH基因在农药霜霉威处理后，不同时间点、不同组织部位的时空表达特征和琥珀酸脱氢酶活性。构建了PBI121-CsSDH植物过表达载体，并通过农杆菌介导法，获得了CsSDH基因的转基因拟南芥植株，主要研究结果如下:
　　(1)以黄瓜品种D0351幼嫩叶片为材料，分离并克隆了黄瓜CsSDH基因，该基因全长834 bp，编码277个氨基酸，氨基酸序列含有2个结构域，在48-152aa具有Fer2保守结构域，此结构域属于Fer2超家族，在酶促反应和电子传递过程中起重要作用。而靠近C-端189-262 aa具有一个Fer417结构域，此结构域属铁硫蛋白超家族(HCP-like superfamily)，在氮代谢中发挥重要作用。系统进化树分析发现黄瓜CsSDH与甜瓜CmSDH关系最近，同源性为96％，与菜豆同源性为85％，与大豆同源性为84％，与鹰嘴豆同源性为86％，与蒺藜苜蓿同源性为84％，与马铃薯和番茄的亲缘关系较远，同源性仅为82％。该基因是一个保守的基因。CsSDH基因编码蛋白是一个不稳定亲水蛋白，不具有跨膜结构，没有信号肽及明显疏水区域;
　　(2)在霜霉威胁迫下，黄瓜低农残品种D0351中，CsSDH基因在果实受霜霉威胁迫后反应迅速，主要在处理前期响应表达强烈，琥珀酸脱氢酶活性显著增加，且该基因表达量显著高于其在高农残品种D9320中表达量。CsSDH在果、叶中表达量较茎中高，且各组织部位表达量高低顺序稳定，为叶＞果＞茎。在黄瓜高农残品种D9320中，CsSDH基因表达量在0.5、1、3、12 h呈现上调表达，6、9h基因表达量与对照组差异不显著，在48 h出现上调表达高峰。这与D0351中该基因的表达规律表现不一致。研究结果通过对比高、低农残中该基因表达情况分析，发现该基因与低农残的相关性，初步确定为低农残相关基因。
　　(3)构建了CsSDH基因过表达载体，命名为PBI121-SDH;并将构建成功的植物表达载体通过冻融法转化到农杆菌LBA4404中。
　　(4)将植物表达载体转化到拟南芥中，经PCR检测，获得了转化PBI121-SDH的阳性植株28株。收获了转基因植株的T1代种子。
　　(5)构建了CsSDH-eGFP融合表达载体，并转化到农杆菌中，利用农杆菌浸润法注射烟草叶片后激光共聚焦显微镜下观察。亚细胞定位研究显示CsSDH基因编码的蛋白主要分布于细胞膜上。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 试验研究目的与意义

1．2 国内外研究进展

1．2．1 农药残留概述

1．2．2 降低农药残留方法研究进展

1．2．3 农药残留相关基因的研究进展

1．2．4 SDH基因的研究进展

1．3 试验研究的内容

1．4 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 试验试剂、酶和菌株

2．2 黄瓜CsSDH基因的克隆

2．2．1 总RNA的提取

2．2．2 cDNA第一条链的合成

2．2．3 引物的设计与合成

2．2．4 黄瓜CsSDH基因PCR扩增

2．2．5 PCR产物的回收与测序

2．3 黄瓜CsSDH基因的序列分析

2．4 黄瓜CsSDH基因在霜霉威处理下的表达分析

2．5 黄瓜琥珀酸脱氢酶在霜霉威处理后的活性变化

2．6 CsSDH基因的过表达片段的获得

2．7 黄瓜CsSDH基因过表达载体的构建

2．7．1 重组质粒和PBI121空载体的双酶切

2．7．2 植物表达载体与目的基因片段的连接与转化

2．7．3 重组子的验证

2．7．4 冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌

2．7．5 农杆菌中重组质粒的PCR及酶切鉴定

2．8 黄瓜CsSDH基因对拟南芥的遗传转化

2．8．1 拟南芥材料

2．8．2 拟南芥转基因植株T0代种子获得

2．8．3 抗性种子的筛选

2．8．4 突变体拟南芥植株的获得及DNA的提取

2．8．5 拟南芥转基因植株的分子检测

2．8．6 拟南芥转基因植株T1代种子的获得

2．9 黄瓜CsSDH基因的亚细胞定位观察

3 结果与分析

3．1 黄瓜CsSDH基因的克隆

3．1．1 基因组总RNA的提取

3．1．2 CsSDH基因的PCR扩增与酶切验证

3．2 CsSDH生物信息学分析

3．2．1 氨基酸序列及理化性质

3．2．2 CsSDH功能结构域分析

3．2．3 CsSDH二级和三维结构分析

3．2．4 CsSDH蛋白的系统进化树

3．3 CsSDH基因在不同品种，不同时间，不同组织部位的表达量分析

3．4 不同品种、不同时间，不同组织部位的琥珀酸脱氢酶活性测定

3．5 CsSDH基因表达载体的构建与验证

3．5．1 CsSDH基因的获得

3．5．2 黄瓜CsSDH基因过表达载体的构建

3．5．3 农杆菌中过表达载体PBI-SDH的PCR及酶切检测

3．6 黄瓜CsSDH基因对拟南芥的遗传转化

3．6．1 拟南芥转基因植株T0代种子获得

3．6．2 抗性种子的筛选

3．6．3 突变体拟南芥植株的获得及DNA的提取

3．6．4 转基因植株PCR检测

3．6．5 拟南芥转基因植株T1代种子的收获

3．7 黄瓜CsSDH基因的亚细胞定位观察

3．7．1 目的基因的PCR扩增

3．7．2 重组表达载体CsSDH-eGFP的构建

3．7．3 烟草亚细胞定位

4 讨论

4．1 霜霉威胁迫下，高低农残品种中黄瓜CsSDH基因的表达量变化

4．2 CsSDH基因编码酶在降低农药残留残过程中的可能作用方式

4．3 黄瓜CsSDH基因对拟南芥的遗传转化

4．4 本研究的创新点

4．5 本研究的不足

4．6 今后研究方向与展望

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文