三氯化铝抑制大鼠骨形成及Wnt/β-Catenin信号转导机制

摘要

为探讨三氯化铝(AlCl3)抑制骨形成的分子机制，本实验将200只4周龄雄性Wistar大鼠随机分成染铝组（AlCl3·6H2O，64mg/kg·B.W.）和对照组（蒸馏水）。实验设染铝30d、60d、90d、120d四个检测点，记录大鼠临床症状和体重，取血清及股骨组织。采用双能X线骨密度仪检测骨密度(BMD);采用火焰原子吸收分光光度法测定血清和骨组织中铝含量，qRT-PCR技术检测Wnt3a、 Fzd2、LRP5、β-catenin、TCF4、c-myc、cyclin D1、Dkk1、sFRP1mRNA的表达;ELISA方法检测Fzd2、LRP5受体活性;western blot方法检测Wnt3a、β-catenin蛋白的表达;采用EMSA方法检测核转录因子TCF4转录活性，结果表明:
　　(1)染铝组大鼠体重显著低于对照组，说明AlCl3暴露抑制大鼠正常的生长发育。
　　(2)染铝组大鼠BMD在120d显著低于对照组，说明AlCl3暴露可诱发骨丢失，抑制骨形成。
　　(3)染铝组大鼠血清和骨中铝含量均显著高于对照组，说明铝可在大鼠骨组织中蓄积。
　　(4)染铝组大鼠骨中Wnt3a mRNA及蛋白表达量，Fzd2、LRP5 mRNA表达量及膜受体活性，自染铝60d显著低于对照组，说明AlCl3可抑制Wnt3a/β-catenin信号通路的启动。
　　(5)染铝组大鼠骨中β-catenin mRNA及蛋白表达量，核转录因子TCF4 mRNA表达量及转录活性自染铝60d显著低于对照组，说明AlCl3下调Wnt3 a/β-catenin信号通路，并抑制核转录因子活性。
　　(6)染铝组大鼠骨中c-myc、cyclin D1 mRNA表达量自染铝60d极显著低于对照组，说明AlCl3抑制Wnt3a/β-catenin信号通路下游靶基因的表达。
　　(7)染铝组大鼠骨中Dkk1 mRNA表达量自染铝60d显著高于对照组;sFRP1 mRNA表达量自染铝90d显著高于对照组，说明AlCl3可诱导Wnt3a/β-catenin信号通路抑制因子的表达，从而抑制Wnt3a/β-catenin信号通路的启动。
　　上述结果说明，铝可促进Wnt/β-catenin信号通路抑制因子Dkk1、sFRP1的表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而下调核转录因子TCF4的表达，导致骨中骨形成相关基因c-myc和cyclin D1的表达减少，最终造成骨形成抑制。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 铝与骨形成

1．2 经典Wnt／β-catenin信号通路与骨形成

1．2．1 Wnt3a蛋白与骨形成

1．2．2 Wnt受体与骨形成

1．2．3 β-catenin与骨形成

1．2．4 转录因子TCF／LEF与骨形成

1．2．5 Wnt／β-catenin通路的靶基因cyclin D1和c-myc与骨形成

1．2．6 Wnt／β-catenin信号通路抑制因子与骨形成

1．3 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验仪器与试剂

2．1．1 实验仪器

2．1．2 试剂

2．2 实验动物及样品采集

2．2．1 实验动物

2．2．2 样品采集及处理

2．3 检测项目与方法

2．3．1 骨密度(BMD)的检测

2．3．2 血清和股骨中铝含量的检测

2．3．3 骨中Wnt3a、Frizzled、LRP5、β-catenin、TCF4、c-myc、cyclin D1、Dkk1和sFRP1 mRNA表达的检测

2．3．4 骨中Frizzled、LRP5受体结合活性检测

2．3．5 骨中Wnt3a、β-catenin蛋白表达的检测

2．3．6 TCF／LEF-1转录活性检测

2．4 实验数据的分析及统计

3 结果与分析

3．1 大鼠体重

3．2 骨密度

3．3 血清和骨中铝的含量

3．4 AlCl3对骨组织中Wnt3a、Fzd2、LRP5、β-catenin、TCF4、c-myc、cyclin D1 mRNA表达的影响

3．5 AlCl3对骨组织中Fzd2、LRP5受体活性的影响

3．6 AlCl3对骨组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达的影响

3．7 AlCl3对骨组织中β-catenin表达的影响

3．8 AlCl3对骨组织中核转录因子TCF4转录活性的影响

3．9 AlCl3对骨组织中Dkk1、sFRP1 mRNA表达的影响

4 讨论

4．1 AlCl3对大鼠对骨形成的影响

4．2 AlCl3对Wnt／β-catenin信号通路的影响

4．3 AlCl3对转录因子TCF4及靶基因c-myc和cyclin D1的影响

4．4 AlCl3对Wnt／β-catenin信号通路抑制因子Dkk1、sFRP1的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文