牛IFn-ω家族抗病毒活性的研究及牛共有IFn-ω的研制

摘要

机体在感染病毒、细菌、寄生虫和真菌时，Ⅰ型干扰素直接或/和间接的通过其他调节因子的诱导对先天性和获得性免疫细胞产生不同的影响。Ⅰ型干扰素对宿主抵抗病毒也有很重要的作用。BoIFN-ω属于Ⅰ型干扰素，本研究从NCBI网站上搜索得到牛干扰素omega(BoIFN-ω)家族24个成员的核苷酸序列，DNAMAN序列分析软件分析发现24个成员中有22个成员是潜在的功能基因，另外2个为假基因，并根据其在染色体的先后顺序对其命名。
　　本研究通过对22条潜在的功能基因序列比对分析，设计简并引物并以牛肝基因组为模板扩增出了BoIFN-ω家族的14个功能基因成员。序列分析结果表明，BoIFN-ω家族的14个成员核苷酸相似性为91.3％～97.2％，氨基酸相似性为84.4％～95.4％。14个成员中除BoIFN-ω11在-COOH端缺失9个氨基酸外，其余都编码195个氨基酸。它们均含有23个氨基酸组成的信号肽，且在成熟肽的1、29、99和139位置有4个保守的半胱氨酸，其中1和99，29和139位置的半胱氨酸可以形成两个二硫键。根据进化树构建和序列比对分析，选取BoIFN-ω家族中的8个成员进行原核表达，并分析比较其理化性质和生物学活性。研究表明这8个成员都有抗VSV活性，其活性均可以被兔抗BoIFN-ω24多克隆血清阻断。在MDBK细胞上抗病毒活性最高的BoIFN-ω13是抗病毒活性最低的BoIFN-ω11的47.5倍。BoIFN-ω10/11/24的抗病毒活性相比较低，BoIFN-ω13/17/23的抗病毒活性相比较高。经过pH2.0和63℃处理后其抗病毒活性都降低，但仍然具有较高的抗病毒活性。抗细胞增殖活性研究表明，8个BoIFN-ω成员均能够抑制MDBK细胞的生长，且呈剂量依赖性。用荧光定量PCR方法检测8个BoIFN-ω成员在MDBK细胞上对Mx1基因表达的影响。结果显示经BoIFN-ω处理过的MDBK细胞中Mx1的mRNA都有不同程度的增多。
　　根据人共有干扰素的设计方法，设计了牛共有干扰素(CoBoIFN-ω）。CoBoIFN-ω是一种重组的非天然的BoIFN-ω，其氨基酸的产生是通过比较BoIFN-ω家族的22个具有潜在功能的成员序列后，把出现频率最高的氨基酸分配到各自相应的位置设计出来的。设计出来的序列经过毕赤酵母密码子优化后，在毕赤酵母中表达。CoBoIFN-ω的抗病毒活性和抗细胞增殖活性都比天然的BoIFN-ω高。此外CoBoIFN-ω处理的MDBK细胞Mx1的mRNA水平高于天然的BoIFN-ω。CoBoIFN-ω在MDBK和PK-15细胞上的抗病毒活性分别是4.6×107 U/mg和1.6×107 U/mg。进一步研究表明经过pH2.0和63℃处理后的CoBoIFN-ω抗病毒活性也降低，这表明CoBoIFN-ω具有干扰素的典型特征。这种基因工程的方法为寻找抗病毒活性更高的蛋白结构提供了一些思路，也可以用于工业化生产。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 Ⅰ型干扰素的抗感染作用

1．1．1 Ⅰ型干扰素的产生及信号通路

1．1．2 Ⅰ型干扰素在病毒感染的保护作用

1．2 IFN-ω干扰素概述

1．3 共有干扰素概述

1．4 重组蛋白在酵母中的表达研究

1．5 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 质粒、宿主菌、病毒

2．1．2 细胞、培养基、血清

2．1．3 主要试剂和仪器

2．2 方法

2．2．1 BoIFN-ω家族成员的克隆及序列分析

2．2．2 pET30a-BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24的表达与纯化

2．2．3 CoBoIFN-ω在毕赤酵母表达系统中的表达

2．2．4 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24和CoBoIFN-ω抗病毒活性的鉴定

2．2．5 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24和CoBoIFN-ω理化性质测定

2．2．6 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24和CoBoIFN-ω抗细胞增殖活性测定

2．2．7 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24和CoBoIFN-ω诱导Mx1基因测定

2．2．8 统计学方法

3 结果与分析

3．1 BoIFN-ω多基因家族的的序列分析

3．2 14个BoIFN-ω家族成员的克隆与序列分析

3．2．1 BoIFN-ω亚型基因的分离

3．2．2 14个BoIFN-ω家族成员克隆载体的构建

3．2．3 14个BoIFN-ω家族成员的序列分析

3．3 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24的表达与纯化

3．4 兔抗BoIFN-ω24多克隆抗体的制备及鉴定

3．5 CoBoIFN-ω在毕赤酵母中的表达

3．5．1 CoBoIFN-ω的设计以及其的密码子优化与合成

3．5．2 CoBoIFN-ω的酵母表达载体的构建

3．5．3 重组GS115-pPICZαA-CoBoIFN-ω酵母菌株蛋白的表达

3．5．4 优势酵母菌株的大剂量诱导表达及鉴定

3．6 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24和CoBoIFN-ω的抗病毒活性

3．7 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24和CoBoIFN-ω的理化性质

3．8 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24和CoBoIFN-ω的抗细胞增殖活性

3．9 BoIFN-ω1／9／10／11／13／17／23／24和CoBoIFN-ω诱导Mx1基因的活性

4 讨论

4．1 BoIFN-ω的结构特点

4．2 BoIFN-ω的生物学活性

4．3 CoBoIFN-ω的设计与表达

4．4 CoBoIFN-ω的生物学活性

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文