原花青素对铅诱导的大鼠肝毒性的保护作用研究

摘要

铅(Lead，Pb)具有柔软、高延展性和抗腐蚀等特点，被广泛应用到现代工业中，尤其是在发展中国家。尽管全球范围内已经采取了各种措施来控制Pb污染，但是每年仍约有2万吨的Pb以烟尘的形式排放到空气中，对人畜健康产生巨大的威胁。约33％被吸收入血的Pb会储存到肝脏中，对肝脏造成严重的损伤。因此，有效地减少Pb在肝脏内的蓄积和对肝组织的损伤是亟待解决的问题。葡萄籽提取物原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)是一种天然抗氧化剂，具有抗炎、抗细菌、抗癌、保护心脏、肝脏和神经等多种生物学作用。本研究采取体内试验和体外试验相结合的方法，来研究GSPE对Pb诱导的大鼠肝脏的损伤、在肝脏和骨中的蓄积、血细胞DNA损伤、氧化应激和细胞凋亡水平的保护作用。
　　体内试验选用6-8周Wistar大鼠40只，随机分成4组，分组情况为Control组、GSPE组、Pb组和Pb+GSPE组，试验周期为30 d。Control组大鼠自由饮水，每天灌服用于溶解GSPE的生理盐水;GSPE组大鼠自由饮水，每天灌服200 mg/kg GSPE溶液;Pb组大鼠饮水中添加2.51 g/L醋酸铅，每天灌服生理盐水;Pb+GSPE组大鼠饮水中添加2.5 g/L醋酸铅，每天灌服GSPE（200 mg/kg）溶液。30d后，采取试剂盒方法检测氧化应激相关指标（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和丙二醛）、细胞凋亡和DNA损伤，生化分析仪测定肝功能指标丙氨酸转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（Aspartate transaminase，AST），采用血球分析仪测定红细胞(Red blood cell，RBC)数量和血红蛋白(Hemoglobin，Hb)浓度，火焰原子吸收光谱法测定肝脏和骨中的Pb含量，免疫印迹试验检测Nrf2信号通路和细胞凋亡信号通路相关蛋白的表达水平。
　　体外试验原代培养Wistar大鼠肝细胞，经糖原染色鉴定肝细胞后，分别进行Pb和GSPE添加，分组如下:Control组、GSPE组(100 mg/L)、Pb组（100μM）和Pb(100μM)+ GSPE(100 mg/L)组，GSPE先添加2h，然后加入Pb孵育24 h，采用试剂盒的方法，按照说明书提供的方法检测肝细胞活率、乳酸脱氢酶释放和肝细胞活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平。
　　结果表明:GSPE能够缓解Pb诱导的RBC数量下降和Hb浓度的降低。由ALT、AST活性和肝组织病理切片结果可见，GSPE的添加有效地减弱Pb对肝脏的损伤。与Control组相比，Pb组超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平显著降低，丙二醛含量显著增加，这些指标提示机体处于氧化应激状态，而GSPE减弱了Pb诱导的氧化应激。Pb组肝脏和骨中Pb含量增加，GSPE处理后骨中的Pb蓄积明显降低;同时，GSPE降低了肝细胞凋亡水平和DNA损伤程度。Pb+GSPE组Nrf2通路相关蛋白Nrf2、Keap1、NQO1和HO-1蛋白表达显著高于Pb组。与Pb组相比，GSPE+Pb组凋亡相关通路中Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表达显著增加，Bax和P53蛋白表达显著降低。体外试验结果表明，GSPE能够阻止Pb诱导的肝细胞活率降低和细胞毒性增加，根据ROS水平检测结果可知，GSPE能够减少Pb诱导的ROS产生，达到降低氧化应激的效果。
　　综上所述，GSPE可以通过减少肝脏细胞凋亡和氧化损伤降低Pb诱导的肝毒性。本研究的开展为将GSPE应用于动物Pb中毒的防治提供理论依据和实践基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 铅(Lead，Pb)及其毒性

1．1．1 概述

1．1．2 Pb的毒代动力学

1．1．3 Pb的毒性

1．1．4 Pb与氧化应激

1．1．5 Pb与凋亡

1．1．6 Pb与Nrf2信号转导通路

1．2 GSPE及其药理作用

1．2．1 概述

1．2．2 GSPE的生物活性

1．3 试验目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要试剂配制

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 体内试验

2．2．2 体外试验

2．3 数据处理

3 结果

3．1 大鼠肝组织病理学变化

3．2 肝脏和骨中Pb蓄积的变化

3．3 血浆中肝功能指标的变化

3．4 全血中RBC数量和Hb浓度

3．5 肝脏匀浆中氧化应激相关指标的变化

3．6 肝脏细胞凋亡变化

3．7 外周血中DNA氧化损伤的变化

3．8 GSPE对Nrf2信号通路的影响

3．9 GSPE对凋亡信号通路的影响

3．10 大鼠原代肝细胞形态及鉴定

3．11 GSPE对Pb暴露大鼠肝细胞活率的影响

3．12 GSPE对Pb暴露大鼠肝细胞LDH释放的影响

3．13 GSPE对Pb暴露大鼠肝细胞ROS生成的影响

4 讨论

4．1 GSPE对Pb暴露大鼠肝脏组织损伤的影响

4．2 GSPE对Pb暴露大鼠肝脏和骨中Pb蓄积的影响

4．3 GSPE对Pb暴露大鼠血液学的影响

4．4 GSPE对Pb暴露大鼠肝脏氧化应激的影响

4．5 GSPE对Pb暴露大鼠肝脏细胞凋亡的影响

4．6 GSPE对Pb暴露大鼠DNA损伤的影响

4．7 GSPE对Pb暴露大鼠肝脏Nrf2信号通路的影响

4．8 GSPE对体外Pb诱导肝细胞活率和LDH释放的影响

4．9 GSPE对体外Pb诱导肝细胞ROS生成的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文