沼液对枯草芽孢杆菌产孢的影响及菌剂初型的制备

摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今研究最为热门的生防菌，含有较为多样的生理习性，容易被分离培养，因能够产生多样抗性的内生芽孢，所以被认为是作为生防菌较好的一种选择。沼液是沼气在发酵后剩余的液体，不仅富含大量可快速被吸收的营养成分，而且还含有其它供微生物生长的物质，如氨基酸、多种微量元素、维生素和其他活性物质。随着我国农村沼气工程的规模不断扩大，沼液资源化安全处理与利用备受重视。利用的枯草芽孢杆菌D1是一株具有拮抗性的细菌，前期试验发现在牛粪沼液中可以生长，进一步优化该菌株利用沼液的能力，为沼液再利用提供了新的代谢途径。该菌株对水稻的立枯病具有较高的拮抗作用，为了能将其更好的保存下来，通过选取优良的载体和稳定的保护剂，在高效利用沼液的同时将其保存，这也为后期在生物农药上利用提供技术参数。但想要将其应用于菌剂的制备，菌体本身芽孢含量是影响实际应用的关键因素，采用分批培养法优化了枯草芽孢杆菌高效利用沼液的产孢培养基;利用比浊法和稀释平板涂布法来检测枯草芽孢杆菌的菌体数量及芽孢产率;利用火焰原子吸收光谱法分析了沼液中金属离的含量，优化产孢培养基成分后进行菌剂载体和保护剂的初步研究，旨在高附值利用沼液，降低生产成本的同时，枯草芽孢杆菌的芽孢产率得到提升，并得到稳定的保存，为后续的实际应用做出理论依据。得到的主要研究结论如下:
　　(1)活化菌株并测定生长曲线。枯草芽孢杆菌D1是革兰氏阳性菌，对立枯病有显著的拮抗作用，在19h时为生长高峰期。
　　(2)利用单因素试验确定枯草芽孢杆菌D1的最佳产孢培养基的最佳碳源是麸皮，最佳氮源是大豆粉;优化后得到一组最优解为培养基的成分为含量为2.45％的麸皮，含量为0.9％的大豆粉和含量为49.01％的沼液，芽孢产率为87.82％。
　　(3)对沼液的性质进行测定。供试沼液中含N1580 mg/Kg、P379 mg/Kg、K998 mg/Kg,该沼液的pH为7.52，总固体含量即TS％为5;沼液中含有能促进枯草芽孢杆菌D1生长的Ca2+、Mn2+、Mg2+这三种离子，检测了沼液中的这三种离子的含量，分别为:Ca2+14.8 mg/L、Mg2+0.151 mg/L、Mn2+0.08 mg/L。
　　(4)对优化产孢培养基后获得的高产菌株剂型的载体及保护剂进行筛选试验，确定枯草芽孢杆菌D1固体剂型的最适载体为硅藻土，同时筛选出最佳保护剂是液体石蜡油，最终有效活菌数量可达到89.9％。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究的目的与意义

1．1．1 研究的意义

1．1．2 研究的目的

1．2 枯草芽孢杆菌的研究与应用

1．2．1 枯草芽孢杆菌生物学特点

1．2．2 微生物农药特性及枯草芽孢杆菌在微生物农药上的应用

1．2．3 国外枯草芽孢杆菌的研究进展

1．2．4 国内枯草芽孢杆菌的研究进展

1．2．5 枯草芽孢杆菌在微生物农药应用中存在的问题

1．3 沼液的利用

1．3．1 沼液利用的现状

1．3．2 沼液作为微生物培养基的基本功能

1．3．3 沼液利用存在的问题

1．3．4 沼液利用的重要意义

1．4 研究内容与技术路线

1．4．1 研究内容

1．4．2 技术路线

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 菌剂载体及保护剂

2．1．4 供试药剂

2．1．5 主要仪器设备

2．2 试验测定指标及方法

2．2．1 细菌生长高峰期时间

2．2．2 细菌总数(OD值)

2．2．3 芽孢形成率

2．2．4 沼液中总氮

2．2．5 沼液中总固体含量(TS)

2．2．6 pH值

2．2．7 沼液中金属离子

2．2．8 各载体吸附力的测定

2．3 数据分析方法

3 试验方案与设计

3．1 菌种的活化

3．2 沼液产孢培养基成分优化单因素试验

3．3 沼液产孢培养基成分优化试验

3．4 沼液营养成分及金属离子含量的测定

3．5 菌剂的载体及保护剂的选择

4 结果与讨论

4．1 菌体生长曲线的测定

4．2 沼液产孢培养基成分优化单因素试验结果

4．2．1 培养基中碳源种类的影响

4．2．2 培养基中氮源种类的影响

4．2．3 培养基中氮源浓度的影响

4．2．4 培养基中碳源浓度的影响

4．3 沼液对产孢的影响

4．3．1 沼液成分

4．3．2 培养基中沼液浓度对产孢的影响

4．3．3 金属离子对产孢的影响

4．4 沼液产孢培养基成分优化试验

4．4．1 Box-Behnken试验设计

4．4．2 试验结果及分析

4．4．3 回归数学模型的建立与显著性检验

4．4．4 响应曲面分析

4．4．5 参数优化与试验验证

4．5 枯草芽孢杆菌D1剂型的初步研究

4．5．1 各种载体的吸附能力的比较

4．5．3 载体种类的影响

4．5．4 保护剂种类的影响

5 结论与创新

5．1 结论

5．2 创新与展望

5．2．1 创新

5．2．2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文