HOG1抑制剂和环境因子对球头三型孢菌产多元醇的影响

摘要

赤藓糖醇作为一种新型的食品甜味剂，甜度约为蔗糖的60％-70％，具备热值低、不影响人体血糖水平和抗龋齿等优良特性，因而市场前景十分广阔。球头三型孢菌利用葡萄糖发酵生产赤藓糖醇的过程中，往往伴随着甘油副产物的产生，这既增大了后期赤藓糖醇的分离纯化难度，又降低了赤藓糖醇的得率。因此，采用合适的调控策略对球头三型孢菌发酵过程进行调控，降低副产物产量，这对于赤藓糖醇的放大化生产尤为重要。因此，针对球头三型孢菌产多元醇的发酵过程调控，本文主要围绕高渗透压甘油途径(High Osmolarity Glycerol Pathway，HOG)抑制剂添加、环境渗透压调节以及环境酸碱度调节等三个方面开展研究，主要研究结果如下:
　　基于HOG1可激活与甘油合成相关酶的基因，研究首先探索了PD169316、SB239063、SB242235、SB202190和SB203580等五种HOG1抑制剂对球头三型孢菌发酵产多元醇的影响。发现SB239063、SB202190和SB203580对赤藓糖醇合成的促进作用从强到弱依次为:SB239063、SB202190和SB203580。而添加PD169316和SB242235反而降低了赤藓糖醇的产量。对SB239063、SB202190和SB203580三种抑制剂的作用效果进一步研究后发现，SB239063对于降低甘油副产物产量提高赤藓糖醇得率的效果最好。SB239063的添加使发酵48 h的球头三型孢菌细胞中胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)的酶活降低了19.06％，使发酵72 h的赤藓糖还原酶(ER)酶活提高了33.20％。其次，Western blot分析结果还显示，SB239063抑制了HOG1的脱磷酸化，降低了HOG1的激酶活性。最后，通过添加10μMSB239063到发酵培养基中，经过120 h的发酵，其产物中甘油产量比对照组降低了20.57％，赤藓糖醇产量提高了31.16％。
　　另一方面，本文研究采用添加无机盐(NaCl和KCl)的方式来探索环境渗透压对球头三型孢菌产多元醇的调控。研究结果表明，相同质量浓度下，KCl对赤藓糖醇产量的提升作用优于NaCl，且添加5g/L KCl时，赤藓糖醇产量比对照组提高了44.21％。进一步的发酵对比实验表明，5g/L KCl的添加提高了发酵后期(84h-120 h)球头三型孢菌细胞内ER的活力，发酵96h时，其酶活为对照组的2.80倍，同时也增大了细胞对葡萄糖的利用速率，发酵120h后，残糖量仅为0.50g/L，而对照组的残糖仍高达21.50g/L。在5-L发酵罐中进行放大，发酵120h后，赤藓糖醇产量达到50.54g/L，比对照组提高了47.69％，而最终的甘油产量只比对照组提高了9.59％。
　　最后，针对球头三型孢菌在发酵前期产生大量有机酸，对细胞造成低pH胁迫的问题，在5-L发酵罐中进行pH控制策略的优化研究。通过对恒定pH(4.5、5.0、5.5和6.0）发酵的结果测定及分析，发现pH5.0最适合球头三型孢菌进行细胞生长，pH6.0则最有利于赤藓糖醇合成。因此在单一pH控制的基础上，本文研究提出两阶段pH控制策略，即:在发酵前期(0-36 h)控制pH5.0，之后控制pH6.0。研究结果表明:在两阶段pH调控发酵时，球头三型孢菌的最大细胞活力比单一控制pH策略的最大细胞活力提高了73.74％，最大ER酶活比单一控制pH策略的最大酶活提高了44.74％，且在发酵120 h后，甘油产量为21.19g/L，与单一pH控制策略中的最低甘油产量(pH5.0，21.18g/L)持平，而赤藓糖醇的产量高达56.78g/L，比单一控制pH的最大产量(pH6.0，46.75g/L)提高了21.45％。
　　本文为进一步研究球头三型孢菌产多元醇的发酵过程提供了技术支撑，也为未来的工业化生产打下了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 赤藓糖醇的性质

1．2．1 赤藓糖醇的独特代谢途径

1．2．2 赤藓糖醇不影响血糖水平

1．2．3 赤藓糖醇具有极低热量值

1．2．4 赤藓糖醇的高耐受量

1．2．5 赤藓糖醇的非致龋齿性

1．3 赤藓糖醇的应用

1．3．1 食品行业

1．3．2 医药行业

1．3．3 化妆品和化工行业

1．4 赤藓糖醇的生产

1．4．1 赤藓糖醇的生产方法

1．4．2 赤藓糖醇发酵工艺的研究进展

1．5 球头三型孢菌

1．6 HOG-MAPK信号途径

1．7 环境渗透压对发酵生产的影响

1．7．1 微生物遇到的主要环境胁迫

1．7．2 渗透压胁迫对微生物生理状态的影响

1．7．3 渗透压胁迫对细胞生长和产物合成的影响

1．8 环境酸碱度对发酵的影响

1．8．1 环境酸碱度对细胞生长和代谢的影响

1．8．2 环境酸碱度对多元醇类生产的影响

1．9 立题意义与研究内容

第二章 HOG1抑制剂对球头三型孢菌产多元醇的调控

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 试剂和材料

2．2．2 主要仪器

2．2．3 菌株和培养基

2．2．4 种子培养方法

2．2．5 摇瓶发酵培养方法

2．2．6 分析方法

2．2．7 抑菌圈实验和酵母细胞活力测定方法

2．2．8 酶活测定方法

2．2．9 Western Blot检测HOG1和Phospho-HOG1表达水平

2．3 结果与讨论

2．3．1 球头三型孢菌生长曲线

2．3．2 球头三型孢菌产多元醇发酵曲线

2．3．3 添加五种HOG1抑制剂发酵对比

2．3．4 添加三种HOG1抑制剂产多元醇发酵时间曲线

2．3．5 添加三种HOG1抑制剂抑菌圈实验和酵母细胞活性测定

2．3．6 添加三种HOG1抑制剂的细胞ctGPD和ER酶活测定

2．3．7 Western Blot检测HOG1和Phospho-HOG1表达水平

2．4 本章小结

第三章 环境渗透压对球头三型孢菌产多元醇的调控

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 试剂和材料

3．2．2 主要仪器

3．2．3 培养基

3．2．4 种子培养方法

3．2．5 摇瓶发酵培养方法

3．2．6 5-L发酵罐发酵

3．2．7 产物分析方法

3．2．8 ER酶活测定

3．3 结果和讨论

3．3．1 NaCl和KCl对甘油和赤藓糖醇生产的影响

3．3．2 添加与未添加5g／L KCl的比较研究

3．3．3 不同时刻添加5 g／L KCl的发酵对比

3．3．4 5-L发酵罐放大实验

3．4 本章小结

第四章 环境酸碱度对球头三型孢菌产多元醇的调控

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试剂和材料

4．2．2 主要仪器

4．2．3 培养基

4．2．4 种子培养

4．2．5 摇瓶发酵培养

4．2．6 5-L发酵罐发酵

4．2．7 产物分析

4．2．8 细胞活力测定

4．2．9 酶活测定

4．3 结果与讨论

4．3．1 初始pH对球头三型孢菌发酵产多元醇的影响

4．3．2 不同恒定pH条件下菌体生物量及残糖对比分析

4．3．3 不同恒定pH条件下多元醇产量对比分析

4．3．4 不同恒定pH条件下G6PDH和ER酶活对比分析

4．3．5 不同恒定pH条件下细胞活力对比分析

4．3．6 球头三型孢菌发酵产多元醇的两阶段pH调控策略

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 主要结论

5．2 展望

5．3 本文创新点

参考文献

致谢

作者简介