分蘖洋葱化感相关基因的克隆及功能分析

摘要

随着设施栽培面积不断扩大，连作现象越来越严重，也成为了亟待解决的问题，而采用合理的轮、间、套作是解决蔬菜连作障碍的有效途径。本课题组多年的研究发现，设施栽培分蘖洋葱伴生番茄后，能有效地减轻番茄病害的发生，促进番茄植株的生长，产量增加5～8％。目前已有很多分蘖洋葱的化感作用分子机理的研究报道，而基因对分蘖洋葱化感作用的调控还尚不清楚。
　　本研究以分蘖洋葱、番茄为试材，利用课题组前期通过的RNA-Seq高通量测序、表达谱DGE结果确定的与分蘖洋葱化感作用相关的两个基因Chi、Pal，采用分子克隆的方法进行3' RACE扩增，首次从分蘖洋葱中克隆得到AcadChi、AcadPal基因全长，构建了超表达载体转化到拟南芥中。研究验证基因相关功能，应用qRT-PCR、PCR-DGGE、Illumian Miseq测序技术等研究其对根区微生物群落分布及丰度、多样性的影响，验证了拟南芥根系分泌物对番茄的化感效应及对番茄黄萎病菌抑菌效应。旨在为揭示分蘖洋葱伴生番茄机理的研究提供理论依据，对研究分蘖洋葱化感作用及其在设施栽培的应用具有一定的指导意义。本研究的主要结论如下:
　　1.采用荧光定量PCR验证化感潜力强、弱的分蘖洋葱材料根系中的差异基因，发现Chi、Pal两个基因随着取样时间的变化，相对表达量均呈现降低-升高-降低的趋势，基因表达趋势与田间试验基本一致。因此，确定Chi、Pal两个基因作为主要的研究对象。
　　2.通过RACE-PCR和RT-PCR的方法克隆得到Chi、Pal基因。分蘖洋葱的AcadChi基因，开放阅读框为633 bp，编码210个蛋白。而AcadPal开放阅读框为2124 bp，编码708个氨基酸的蛋白质。成功建立了Chi、Pal基因的超表达载体pCAMBIA1301-Chi（Pal）。
　　3.Chi基因的过表达促进了拟南芥开花，具有促进植物由营养生长向生殖生长转变的作用，对于叶片、抽薹的形成都具有明显的调控作用;Pal在拟南芥中过表达同样促进了拟南芥开花，同时影响了叶色的变化。
　　4.Chi、Pal基因的过表达，能够促进拟南芥叶片、根中类黄酮的有效积累，类黄酮含量显著增加(p＜0.05），说明Chi、Pal基因是在类黄酮合成途径中起作用的基因。Pal的过表达到拟南芥，转Pal基因拟南芥叶片总叶绿素含量要显著高于野生型和Pal突变体(p＜0.05)，表明基因在拟南芥中得到了有效表达。探讨了Chi、Pal基因在拟南芥体内的表达模式，转AcadChi、AcadPal基因拟南芥各组织的的表达量均高于野生型拟南芥，其表达量均为叶＞茎＞根。
　　5.DGGE和qPCR结果表明，转Chi、Pal基因影响了拟南芥根区细菌和真菌群落结构和群落丰度。转Chi、野生型与突变体拟南芥相比，显著提高了土壤细菌多样性指数和均匀度指数(p＜0.05），显著降低了真菌均匀度指数(p＜0.05）。转Chi基因、野生型拟南芥土壤细菌16S rDNA基因群落丰度显著高于突变体(p＜0.05），真菌群落丰度相对突变体显著下降(p＜0.05)。转Pal拟南芥土壤细菌群落丰度显著高于突变体(p＜0.05）。
　　6.通过Illumian Miseq高通量测序结果表明，转Chi、Pal基因拟南芥改变了土壤细菌群落丰度、多样性指数和组成。转Chi、Pal基因提高了细菌丰富度指数和多样性指数。转Chi基因处理增加了蓝藻菌门、芽孢杆菌门、γ-变形菌纲、蓝藻菌纲的相对百分丰度。转Pal基因增加了变形菌门、α-变形菌纲、的δ-变形菌纲、厌氧绳菌纲的相对百分丰度。主成分分析(PCoA)和坐标轴(PCA)图分析表明，不同拟南芥的土壤细菌群落结构不同。转Chi、Pal基因拟南芥与野生型、突变体拟南芥相比细菌群落结构均有较大差异;三者距离较远，说明土壤细菌群落结构差异较大，转基因改变了土壤细菌群落结构。通过对进化分支图(LEfSe)的分析，确定了拟南芥显著性差异的类群，转Chi基因拟南芥土壤中主要的微生物类群为蓝藻门、黄色单孢菌目（科）、红杆菌且（科）等。转Pal基因拟南芥土壤中主要的的微生物类群为绿弯菌门、蓝藻门、α-变形菌纲、γ-变形菌纲、厌氧绳菌纲（目）、粘球菌目、红螺菌科等。
　　7.不同拟南芥根系分泌物对番茄种子发芽均有促进作用，转Chi、Pal的拟南芥根系分泌物显著促进胚根伸长和全株干、鲜重(p＜0.05）。拟南芥根系分泌物对番茄黄萎病菌有显著的抑制作用(p＜0.05）。转Pal基因处理菌落显著小于其它各处理(p＜0.05）。转Chi、Pal基因的抑菌率高于野生和突变体。
　　综上结果表明:本文验证了分蘖洋葱/番茄伴生中得到的Chi、Pal基因的功能。转Chi、Pal基因改变了植株的表型，提高了植株黄酮类含量，影响了拟南芥根区细菌和真菌群落结构和群落丰度，改变了土壤细菌的多样性;证明了转Chi、Pal基因提高了拟南芥的化感作用和抑菌作用，进一步证实Chi、Pal基因与化感作用有关。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究目的与意义

1．2 国内外研究的动态

1．2．1 葱蒜属植物在设施栽培中缓解连作障碍的研究进展

1．2．2 化感基因的研究进展

1．2．3 酚酸类物质的研究进展

1．2．4 查尔酮异构酶、苯丙氨酸解氨酶的研究进展

1．3 本研究的主要内容及技术路线

1．3．1 本研究的主要内容

1．3．2 本研究的技术路线

2 分蘖洋葱／番茄伴生化感作用相关基因的表达分析

2．1 引言

2．2 试验材料和仪器药品

2．2．1 试验材料

2．2．2 化学试剂

2．2．3 仪器设备

2．2．4 实验设计

2．3 试验方法

2．3．1 分蘖洋葱总RNA的提取

2．3．2 cDNA第一链合成

2．3．3 荧光定量PCR检测

2．3．4 荧光定量PCR分析

2．3．5 数据处理与分析

2．4 结果与分析

2．4．1 RNA提取及纯化

2．4．2 分蘖洋葱化感相关基因的相对定量分析

2．4．3 分蘖洋葱不同部位的基因表达分析

2．5 讨论

3 分蘖洋葱化感相关Chi基因的克隆与功能分析

3．1 引言

3．2 试验材料和仪器药品

3．2．1 试验材料

3．2．2 化学试剂

3．2．3 仪器设备

3．2．4 试验设计

3．3 试验方法

3．3．1 分蘖洋葱总RNA的提取

3．3．2 Chi基因全长的克隆

3．3．3 超表达载体的构建

3．3．4 拟南芥的遗传转化

3．3．5 分蘖洋葱Chi基因的功能分析

3．4 结果与分析

3．4．1 分蘖洋葱Chi基因的克隆及序列分析

3．4．2 超表达载体的构建

3．4．3 Chi基因拟南芥的相关功能验证

3．5 讨论

3．5．1 Chi基因的鉴定

3．5．2 转Chi基因对拟南芥的影响

3．5．3 拟南芥根际土壤微生物群落的研究

3．5．4 拟南芥根系分泌物对番茄的化感效应及抑菌效应

4 分蘖洋葱化感相关Pal基因的克隆与功能分析

4．1 引言

4．2 试验材料和仪器药品

4．2．1 试验材料

4．2．2 化学试剂

4．2．3 仪器设备

4．2．4 试验设计

4．3 试验方法

4．3．1 Pal基因全长的克隆

4．3．2 超表达载体的构建

4．3．3 拟南芥的遗传转化

4．3．4 分蘖洋葱Pal基因的功能分析

4．4 结果与分析

4．4．1 分蘖洋葱Pal基因的克隆及分析

4．4．2 超表达载体的构建

4．4．3 Pal基因相关功能验证

4．5 讨论

4．5．1 Pal基因的鉴定

4．5．2 转Pal基因对拟南芥表型的影响

4．5．3 拟南芥根际土壤微生物群落的研究

4．5．4 拟南芥根系分泌物对番茄的化感效应及抑菌效应

5 结论和展望

5．1 主要结论

5．2 本研究的创新点

5．3 展望

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文