猫杯状病毒2280毒株反向遗传系统的建立及初步应用

摘要

猫杯状病毒(Feline Calicivirus，FCV)属于杯状病毒科水疮性病毒属，是感染家猫及野生猫科动物的重要病原之一。FCV感染家猫能够引起呼吸系统疾病、口腔溃疡、结膜炎及慢性肠炎等，强毒感染引起全身系统性疾病(Virulent systemic disease，VSD)并导致较高死亡率。目前，对于该病的预防，仍以疫苗免疫为主，但现有疫苗仅能提供一定的临床保护而不能完全阻止FCV感染，并且康复动物长期持续的排毒，使得该病的防治更加困难。
　　FCV2280是一株中等毒力的毒株，能引起泛嗜性感染，为了对FCV2280的致病机制有进一步的了解，我们需要利用反向遗传操作系统来研究病毒基因组结构和功能的关系。我们以pOK-12为载体构建了FCV2280株的反向遗传系统。首先，依据FCV2280基因组酶切位点特征，将基因组分为三段依次克隆于pOK-12载体中;同时在基因组5'末端和3'末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子和丁型肝炎核酶（HdvRz）序列;并将基因组554位的XbaⅠ限制性酶切位点序列进行同义突变作为重组病毒鉴定的遗传标记，获得基因组全长cDNA表达质粒pOK-2280。其次，将该表达质粒线性化和体外转录加帽后，获得基因组RNA;转染CRFK细胞，获得P1代重组病毒;提取病毒基因组RNA制各cDNA模板，对遗传标记进行PCR扩增和XbaⅠ酶切鉴定，结果表明拯救的病毒为重组FCV病毒。最后，生长曲线检测结果显示重组病毒与亲本病毒生长动力学无明显差异。
　　为了鉴定FCV2280毒株外源基因插入位点，首先，以pOK-2280为基础，分别以p5.6基因的5'末端、p76基因3'末端、VP1基因5'末端及VP1基因第264～265核苷酸之间作为插入位点，构建表达增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的表达质粒。其次，表达质粒经体外转录和转染CRFK细胞后拯救重组病毒，所获重组病毒分别感染CRFK细胞，进行eGFP表达鉴定，结果表明，只有在VP1基因5'末端以及VP1基因第264～265核苷酸之间两个位点的eGFP可以表达。最后，对eGFP的遗传稳定性进行鉴定，结果表明VP1基因5'末端为插入位点的重组病毒传至第二代时观察不到荧光，而另一组重组病毒传至第5代时观察不到荧光，因此，其稳定性有待进一步提高。
　　通过本研究，我们成功建立了FCV2280株反向遗传操作系统，并应用该系统对外源基因的插入位点进行初步筛选，这将为猫杯状病毒致病机制的研究奠定基础，也为活载体疫苗研发提供参考。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 猫杯状病毒感染概述

1．1．1 流行病学特征

1．1．2 病原学特征

1．1．3 FCV基因组结构及其编码产物

1．1．4 临床症状及病理变化

1．1．5 FCV感染机制

1．2 RNA病毒的反向遗传学技术

1．2．1 概述

1．2．2 表达系统的选择

1．3 FCV反向遗传研究进展

1．3．1 FCV反向遗传应用

1．3．2 反向遗传学技术在FCV疫苗研究的进展

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 毒株、载体与质粒

2．1．2 细胞与病毒

2．1．3 主要试剂

2．1．4 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计与合成

2．2．2 克隆载体pOK-12改造

2．2．3 FCV全长cDNA感染性克隆的构建

2．2．4 FCV的拯救

2．2．5 重组病毒的鉴定

2．2．6 亲本病毒与重组病毒生长曲线测定

2．2．7 表达eGFP重组病毒的拯救

3 结果

3．1 FCV全长cDNA感染性克隆的构建

3．2 FCV的拯救

3．3 拯救病毒的鉴定

3．4 亲本病毒与拯救病毒生长动力学比较

3．5 表达eGFP重组病毒的拯救

3．6 r2280-eGFP与亲本病毒生长动力学比较

4 讨论

4．1．3 拯救系统的选择

4．1．4 转染方法的选择

4．1．5 忠实性cDNA克隆的获得

4．1．6 拯救病毒的鉴定

4．2 FCV反向遗传的应用

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文