REV感染对SPF雏鸡免疫器官免疫功能及Cyclin D1表达的影响

摘要

禽网状内皮增生病(RE)是禽类重要的免疫抑制性致瘤性疾病之一，但由于其临诊症状不典型，该病长期以来没有得到足够重视，现今我国养禽业对禽网状内皮增生病(RE)的预防和防控已经逐渐重视起来，该病由禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)引起。细胞周期素D1(Cyclin D1)是一类与细胞周期功能状态密切相关的蛋白质家族，通过与特定蛋白激酶结合并激活其活性在调节细胞周期G1期到S期中起关键作用。本研究以1日龄SPF雏鸡为研究对象，在成功制备出兔抗鸡Cyclin D1多克隆抗体的基础上，应用流式细胞术检测其免疫器官中淋巴细胞细胞周期分布及CD4+、CD8+T淋巴细胞数量及比值变化、应用细胞培养结合MTT法检测免疫器官中T、B淋巴细胞增殖功能变化、应用RealTime PCR技术检测免疫器官中Cyclin D1 mRNA表达的变化、应用间接ELISA法检测CyclinD1蛋白含量变化。通过上述各项被检指标的检测，较全面系统的研究了REV感染对SPF雏鸡免疫器官的免疫功能及Cyclin D1表达的影响，为RE防治提供方向。研究结果如下:
　　(1)1日龄SPF雏鸡感染REV后，其免疫器官胸腺和脾脏中，T淋巴细胞增殖功能于REV感染后第1-49 d均不同程度地低于对照雏鸡，两者于病毒感染后第14-28 d与对照雏鸡比较均极显著降低(P＜0.01);法氏囊未见统计学差异。胸腺CD4+T淋巴细胞数量在REV感染后14-28 d与对照雏鸡相比显著(P＜0.05)或极显著降低（P＜0.01）。CD8+T淋巴细胞数量于REV感染后21-35 d极显著低于对照雏鸡(P＜0.01);在脾脏中CD4+T淋巴细胞数量于病毒感染后7-35 d显著(P＜0.05)或极显著（P＜0.01）低于对照雏鸡。CD8+T淋巴细胞数量在REV感染后第3d、第14d及第28d与对照雏鸡相比极显著降低(P＜0.01);法氏囊CD4+T淋巴细胞数量于病毒感染后3-14 d和第28 d与对照雏鸡相比极显著降低（P＜0.01）。CD8+T淋巴细胞数量于病毒感染后第1d极显著低于对照雏鸡（P＜0.01），第7d显著高于对照雏鸡(P＜0.05)，35-49 d极显著高于对照雏鸡（P＜0.01）。胸腺、脾脏、法氏囊CD4+/CD8+T淋巴细胞比值于病毒感染后与对照雏鸡比较出现不同程度的降低（P＜0.01或P＜0.05）。表明REV感染1日龄SPF雏鸡后，其主要免疫器官（胸腺、脾脏、法氏囊）细胞免疫功能呈现不同程度的抑制。
　　(2)1日龄SPF雏鸡感染REV后，法氏囊B淋巴细胞增殖功能于病毒感染后14-35 d极显著低于对照雏鸡（P＜0.01），其余未见统计学差异(P＞0.05)。脾脏B淋巴细胞增殖功能在病毒感染后14-49 d显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)下降，其余未见统计学差异(P＜0.05)。表明1日龄SPF雏鸡感染REV后，其法氏囊等免疫器官的体液免疫功能也不同程度下降。
　　(3) REV感染1日龄SPF雏鸡后14-28 d，其胸腺、脾脏、法氏囊淋巴细胞中G0/G1期和S期细胞数占细胞总数的比例与对照雏鸡比较不同程度增高，细胞主要集中在S期中进行DNA复制，G2/M期细胞数比例少。表明REV感染1日龄雏鸡后，其免疫器官中淋巴细胞细胞周期发生变化，S期细胞比例增多，G2/M期的细胞数比例较少，细胞大量停滞于S期，表明细胞增殖受到抑制。
　　(4) REV感染1日龄SPF雏鸡后，其胸腺中Cyclin D1 mRNA表达量不同程度高于对照雏鸡。其中，Cyclin D1 mRNA表达量于REV感染后14-28 d显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于对照雏鸡;Cyclin D1蛋白含量在REV感染后第7d较对照雏鸡极显著降低(P＜0.01)，第14d较对照组雏鸡显著降低(P＜0.05)，在第35d显著高于对照雏鸡(P＜0.05)，但未见统计学差异。脾脏中Cyclin D1 mRNA表达量于REV感染后14-21 d极显著(P＜0.01)高于对照雏鸡，第28d显著(P＜0.05)高于对照雏鸡，其余未见统计学差异(P＞0.05); CyclinD1蛋白含量在病毒感染后第1d和第49 d与对照雏鸡相比显著增高（P＜0.05），第7d及第21-35 d极显著增高(P＜0.01)。法氏囊中Cyclin D1 mRNA表达量于病毒感染后第21-28 d显著高于对照雏鸡（P＜0.05）;Cyclin D1蛋白含量在病毒感染后第21d显著增高(P＜0.05)，第14d、第28 d及第49 d极显著增高(P＜0.01)。表明SPF雏鸡免疫器官Cyclin D1 mRNA表达及其蛋白含量增多与REV的致病过程及细胞周期分布密切相关。

目录

声明

摘要

1 引言

1．2．2 REV基因组、蛋白结构及其遗传学特点

1．2．3 REV流行病学

1．2．4 REV混合感染

1，2．5 REV感染动物临诊主要症状及病理变化

1．2．6 REV感染动物免疫抑制机制

1．2．7 REV与肿瘤

1．2．8 REV的公共卫生意义及预防措施

1．3 细胞周期及其研究进展

1．3．1 细胞周期概述

1．4 细胞周期素及其研究进展

1．4．1 细胞周期素概述

1．4．2 Cyclin D1及其研究进展

1．5 本项目研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 REV毒株

2．1．3 主要生物制剂及化学试剂

2．1．4 主要仪器与设备

2．1．5 常用溶液及其配制

2．2 实验方法

2．2．1 实验动物分组及其处理

2．2．2 待检材料采取及其处理

2．2．3 检测指标及方法

2．3 数据处理

3 结果与分析

3．1 REV感染SPF雏鸡免疫器官细胞免疫功能变化

3．1．1 REV感染SPF雏鸡胸腺和脾脏T淋巴细胞增殖功能变化

3．1．2 REV感染SPF雏鸡免疫器官CD4+T淋巴细胞数量变化

3．1．3 REV感染SPF雏鸡免疫器官CD8+T淋巴细胞数量变化

3．1．4 REV感染SPF雏鸡免疫器官CD4+／CD8+T淋巴细胞比值变化

3．2 REV感染SPF雏鸡法氏囊和脾脏B淋巴细胞增殖功能变化

3．3 REV感染SPF雏鸡免疫器官细胞周期的变化

3．3．1 REV感染SPF雏鸡胸腺淋巴细胞细胞周期变化

3．3．2 REV感染SPF雏鸡脾脏淋巴细胞细胞周期变化

3．3．3 REV感染SPF雏鸡法氏囊淋巴细胞细胞周期变化

3．4 雏鸡免疫器官Cyclin D1 mRNA表达及Real Time-PCR检测方法的建立

3．4．1 总RNA提取

3．4．2 雏鸡免疫器官Cyclin D1 mRNA表达韵变化

3．5 REV感染SPF雏鸡免疫器官中Cyclin D1 mRNA表达变化

3．5．1 REV感染SPF雏鸡胸腺中Cyclin D1 mRNA表达变化

3．5．2 REV感染SPF雏鸡脾脏中Cyclin D1 mRNA表达变化

3．5．3 REV感染SPF雏鸡法氏囊中Cyclin D1 mRNA表达变化

3．6 鸡Cyclin D1原核表达及多克隆抗体制备

3．6．1 鸡Cyclin D1基因克隆及序列分析

3．6．2 重组蛋白表达条件优化

3．6．3 SDS-PAGE分析蛋白表达

3．6．4 重组蛋白切胶纯化

3．6．5 融合蛋白Cyclin D1 Western blotting检测

3．6．6 Western blotting检测Cyclin D1克隆抗体的特异性

3．6．7 兔抗鸡Cyclin D1多克隆抗体效价测定

3．7 REV感染SPF雏鸡免疫器官中Cyclin D1蛋白含量变化

3．7．1 REV感染SPF雏鸡胸腺中Cyclin D1蛋白含量变化

3．7．2 REV感染SPF雏鸡脾脏中Cyclin D1蛋白含量变化

3．7．3 REV感染SPF雏鸡法氏囊中Cyclin D1蛋白含量变化

4 讨论

4．1 REV感染对SPF雏鸡胸腺和脾脏细胞免疫功能变化的影响

4．2 REV感染对SPF雏鸡免疫器官B淋巴细胞增殖功能的影响

4．3 REV感染对SPF雏鸡免疫器官Cyclin D1表达的影响

4．4 REV感染对SPF雏鸡的免疫器官淋巴细胞细胞周期的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文