对稻飞虱有杀虫活性的Bt菌株的作用机制初探

摘要

水稻稻飞虱严重危害水稻生产危及粮食安全，生产防治过程中严重依赖化学防治，造成环境污染，稻飞虱抗药性的增强。稻飞虱作为刺吸式口器的农业害虫，取食部位是水稻的筛管，无法取食水稻叶表的Bt，通常认为Bt的杀虫特异性是昆虫和Bt在自然界中长期共进化产生的。实验室前期，发现了一株对稻飞虱有高效杀虫活性的菌株(IPPBIOTSUC1012，Bt1012)，那么稻飞虱无法直接取食Bt，那么Bt1012的具体杀虫机制是怎么的？于是本研究针对Bt1012与稻飞虱之间的作用方式进行了探究。 (1)首先，本研究针对共进化过程中的第一个关键问题进行了研究。既然稻飞虱无法取食Bt，两者存在共进化的唯一来源就是Bt1012菌株内生进入水稻，从而增加二者的接触性。本研究分析了Bt1012菌株在灰飞虱寄主（水稻）中内生的情况。激光共聚焦检测结果显示，绿色荧光蛋白标记的菌株Bt1012可以内生到水稻中。 (2)既然Bt1012可以内生进入水稻那么，稻飞虱能否取食到Bt1012的芽胞和晶体。首先我们测试了Bt1012菌株的芽胞宽度和晶体直径（分别为～740 nm、～810 nm），结果发现Bt1012菌株的芽胞和晶体与稻飞虱的口针直径大小(≤1μm)相近。为了进一步确定稻飞虱的取食范围，通过饲喂灰飞虱不同直径大小(100 nm、625 nm、1350 nm)的荧光纳米微球，检测灰飞虱中肠荧光信号，结果发现灰飞虱可以取食100nm的微球颗粒，只有少量个体可以摄入625 nm微球颗粒，说明灰飞虱口器可取食的颗粒大小约625 nm。饲喂Bt菌株(HD73-)芽胞水悬液后发现灰飞虱死亡率超过了90％，阴性对照有10％左右的致死率，上述结果说明芽胞和晶体可以导致灰飞虱死亡，致死原因是芽胞和晶体堵塞了灰飞虱口器。 (3)灰飞虱无法取食Bt的芽胞的晶体，那么Bt1012菌株发挥作用的方式只有在体外条件下降晶体溶解，从而被灰飞虱取食。Bt1012晶体溶解性分析结果显示Cry64Ba-Cry64Ca杀虫蛋白可以在中性(PH=7)条件下溶解，并且蔗糖对其溶解有促进作用，这与其他杀虫蛋白需要碱性条件溶解不同。同时Cry64Ba和Cry64Ca只有在共表达的情况下对稻飞虱有很强的杀虫活性，单独表达的Cry64Ba和Cry64Ca均对稻飞虱失去杀虫活性。 (4) Cry64Ba-Cry64Ca蛋白、Cry78Aa蛋白与灰飞虱BBMV的结合实验表明，灰飞虱中肠BBMV上有Cry78Aa1蛋白的特异结合位点，且Cry64Ba-Cry64Ca蛋白的特异性结合位点多于Cry78Aa1蛋白。 上述研究数据显示，自然界中，菌株Bt1012可能通过内生到水稻中，表达并溶解释放Cry64Ba和Cry64Ca杀虫蛋白，进而对稻飞虱产生作用。在此过程中水稻是Bt菌株与昆虫相互作用的重要媒介。然而该菌株与水稻及稻飞虱三者间的相互作用以及水稻能否表达Cry64蛋白并被灰飞虱取食等问题有待进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 水稻虫害及其防治

1．1．1 水稻种植及其主要虫害

1．1．2 水稻害虫的防治策略

1．2 苏云金芽胞杆菌

1．2．1 苏云金芽胞杆菌及Bt杀虫蛋白

1．2．2 Bt与半翅目昆虫

1．3 内生菌

1．3．1 内生菌的作用

1．3．2 植物与微生物之间的相互作用

1．3．3 菌株内生方式

1．3．5 植食性昆虫-植物的相互适应性

1．4 本研究的目的与意义

第二章 IPPBIOTSUC1012菌株在水稻中内生的分析

2．1 材料与试剂

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 供试虫源

2．1．3 人工饲料

2．1．6 常用溶液与缓冲液

2．1．7 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 gfp片段的扩增

2．2．2 目的产物的纯化与连接转化

2．2．3 阳性克隆的鉴定

2．2．4 大肠杆菌质粒的提取

2．2．5 ET感受态制备和转化

2．2．6 IPPBIOTSUC1012菌株感受态的制备与转化

2．2．7 激光共聚焦观察水稻内生菌

2．2．8 水稻中内生菌的分离与鉴定

2．2．9 IPPBIOTSUC1012菌株晶体和芽胞大小测量

2．2．10 生物活性测定体系的建立

2．2．11 荧光纳米微球试验

2．2．12 芽胞和晶体混合物的制备

2．2．15 灰飞虱取食水稻的情况调查

2．3 实验结果

2．3．1 gfp片段的扩增与载体的构建

2．3．2 GFP标记菌株的形态学观察

2．3．3 激光共聚焦检测水稻中内生菌的分布

2．3．4 水稻中内生菌的分离与鉴定

2．3．5 IPPBIOTSUC1012菌株晶体和芽胞大小的测量

2．3．6 荧光纳米微球实验

2．3．7 晶胞混合物的生测

2．3．8 IPPBIOTSUC1012菌株溶解性实验

2．3．9 IPPBIOTSUC1012菌株水溶液生测实验

2．3．10 内生菌有对灰飞虱种群差异的影响

2．4 讨论

第三章 对灰飞虱有活性的三种蛋白的作用机制初探

3．1 材料与试剂

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 供试虫源

3．1．3 培养基和抗生素

3．2 实验方法

3．2．1 目的片段的PCR扩增

3．2．2 PCR产物回收

3．2．3 连接转化

3．2．4 ET感受态制备和转化

3．2．5 HD73无晶体突变株感受态制备与转化

3．2．6 阳性克隆的PCR鉴定

3．2．12 Cry78Aa蛋白与Cry64Ba-Cry64Ca蛋白的同源和异源竞争

3．3 实验结果

3．3．1 cry64Ba和cry64Ca目的片段的扩增

3．3．2 Cry64Ba和Cry64Ca蛋白的单独表达

3．3．3 Cry64单独表达蛋白的生测

3．3．4 Cry78Aa1蛋白与灰飞虱BBMV的饱和结合

3．3．5 Cry78Aa蛋白与Cry64Ba-Cry64Ca蛋白的同源和异源竞争

3．4 讨论

全文总结

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文