Pyolysin成孔活性与其诱导体外培养巨噬细胞凋亡能力的研究

摘要

化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes，T.pyogenes）是人和多种动物的条件性致病菌。T.pyogenes是引起肺炎、乳房炎、子宫内膜炎等多种器官和黏膜化脓性感染的重要病原菌之一，严重时也可导致脓毒败血症使动物死亡，给养殖业造成较大的经济损失。
　　溶血素(Pyolysin，PLO)是T.pyogenes分泌的一种外毒素，也是唯一一种溶血素。PLO作为胆固醇依赖性溶细胞素(Cholesterol-dpendent cytolysin，CDCs)家族成员，可以通过与细胞膜上的胆固醇结合形成穿膜孔道而发挥其溶细胞效应。但PLO在T.pyogenes感染过程中发挥的作用尚未完全阐明。
　　本研究首先用T.pyogenes通过呼吸道接种小鼠。结果表明，T.pyogenes能在小鼠肺脏内增殖并扩散到其他器官，最终导致动物死亡。Western blot检测表明，T.pyogenes感染能够导致小鼠脾脏和肺脏中caspase-3和caspase-9的活化。T.pyogenes和灭活T.pyogenes分别作用小鼠巨噬细胞，发现T.pyogenes能激活caspase-3，而灭活的T.pyogenes不能。上述结果表明，T.pyogenes感染能导致小鼠细胞发生凋亡，而上述效应可能与T.pyogenes分泌的外毒素——PLO有关。
　　随后本研究将重组PLO(recombinant PLO，rPLO)第238位天冬氨酸(D)替换为精氨酸(R)，制各了rPLO D238R。检测表明，rPLO D238R溶血活性显著低于rPLO。对rPLO D238R的鉴定表明，其结合细胞膜的能力与rPLO相似，但在含胆固醇的脂质体上形成高分子量寡聚体的能力显著减弱。透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)观察发现，rPLO可在细胞膜上形成典型的穿膜孔道结构，而rPLO D238R不能。另外rPLO D238R对L929和MDBK细胞的毒性也显著低于rPLO。上述结果表明，rPLO的成孔活性和溶细胞活性与其膜结合能力和寡聚化能力密切相关。
　　本研究发现，rPLO作用小鼠巨噬细胞后，细胞中caspase-2/3/6/8/9的活化水平明显升高;Western blot结果显示PLO作用巨噬细胞后可导致caspase-3/9/12的活化，rPLO D238R和rPLO P499F（本实验室构建的另一种rPLO突变体，其与细胞膜结合的能力和溶血活性显著降低）不导致上述现象。上述结果说明，PLO的成孔活性在其诱导巨噬细胞凋亡的过程中起关键性作用。
　　Western blot和流式细胞术检测结果表明，rPLO作用小鼠巨噬细胞后，可导致线粒体膜电位（△Ψm）的改变及线粒体中细胞色素C(Cytochrome C)的释放，同时可导致细胞中活性氧簇(ROS)含量的增加。上述结果表明，PLO诱导小鼠巨噬细胞凋亡的过程与细胞凋亡的线粒体途径活化有关。
　　Z-LEHD-FMK（caspase-9抑制剂）、Z-VAD-FMK（caspase抑制剂）、BAPTA-AM（胞内Ca2+螫合剂）和NAC(ROS消除剂)与rPLO共同作用小鼠巨噬细胞，发现上述抑制剂能够抑制rPLO诱导的caspase-3的活化。上述结果证明，线粒体途径参与了PLO导致的小鼠巨噬细胞凋亡。
　　综上，本研究证实了T.pyogenes分泌的PLO能够通过激活线粒体途径导致巨噬细胞中caspase-3的活化和细胞凋亡的发生，且这种能力与PLO结合细胞膜并在细胞膜上寡聚化形成穿膜孔道的能力直接相关。本研究的结果为全面理解T.pyogenes感染过程中PLO发挥毒力效应的机制提供了部分依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 化脓隐秘杆菌

1．1．1 化脓隐秘杆菌概述

1．2 PLO

1．2．1 PLO的结构与功能

1．2．2 PLO在T．pyogenes感染中的作用

1．3 巨噬细胞

1．3．1 巨噬细胞的功能

1．3．2 Mφ与机体的免疫防御

1．4 细胞凋亡

1．4．1 细胞凋亡概述

1．4．2 细胞凋亡的途径

1．4．3 细胞凋亡与线粒体

1．4．4 细胞凋亡对产CDCs细菌感染的影响

1．5 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株、质粒

2．1．4 主要试剂和仪器

2．2 方法

2．2．2 T． pyogenes对Mφ凋亡的影响

2．2．3 rPLO及其突变体蛋白的制备和鉴定

2．2．4 PLO诱导Mφ凋亡的机制

3 结果

3．2 T． pyogenes对Mφ凋亡的影响

3．3 rPLO及其突变体蛋白的制备和鉴定

3．3．1 rPLO突变体重组表达质粒的构建与表达

3．3．2 rPLO及其突变体蛋白的特性分析

3．4 PLO诱导Mφ凋亡的机制

3．4．2 rPLO处理对Mφ膜完整性的影响

3．4．3 rPLO诱导细胞凋亡过程中caspases活化情况的摸索

3．4．4 线粒体途径与rPLO诱导的Mφ凋亡的关系

4 讨论

4．3 PLO成孔活性与其诱导的Mφ凋亡之间的关系

4．5 PLO诱导的Mφ凋亡对T． pyogenes感染疾病发生的关系

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文