狂犬病病毒感染细胞和小鼠的lncRNA和mRNA表达谱变化

摘要

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染哺乳动物中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的传染性疾病。狂犬病是人畜共患病，病死率极高，一旦出现临床症状，死亡率高达100％。据世界卫生组织统计，全球范围内每年有超过5万人死于狂犬病，但绝大多数病例发生在亚洲和非洲等发展中国家。狂犬病病毒可以感染几乎所有的温血动物，野生动物是其主要的储存宿主，人和各种哺乳动物为传播宿主。带毒动物唾液中具有感染性的病毒粒子经抓咬挠伤造成宿主皮肤或粘膜受损随后侵入机体，对CNS侵染随后发病死亡。
　　长链非编码RNA(Long-chain noncoding RNA，lncRNA)是一种长度大于200nt，缺乏阅读框且不编码蛋白质的RNA分子，它在细胞核和细胞质中均有分布。lncRNA虽然不编码蛋白质，但却参与DNA甲基化、转录激活调控并干扰、细胞核内运输翻译等重要调控过程。lncRNA可通过转录和转录后水平调控基因表达的调控以及对基因进行表观遗传学修饰。
　　机体抗RABV感染主要依靠固有免疫，尤其是Ⅰ型干扰素反应。病毒感染后，体内细胞表面受体和胞内受体可识别相关模式分子，激活信号通路并诱导细胞分泌Ⅰ型干扰素。越来越多的证据表明，lncRNA在宿主抗病毒反应、固有免疫中起重要的调节作用。然而，对RABV诱导宿主免疫应答中的lncRNA的表达谱和功能尚不清楚。因此阐述RABV感染诱导的lncRNA表达谱变化对深入探索RABV的致病机制及其防治策略具有重要意义。
　　本实验在细胞水平和小鼠脑组织水平上通过小RNA测序分析RABV感染中lncRNA和mRNA表达谱。首先利用SRV9和CVS11两种病毒分别感染BHK21细胞，感染12h，24h，48h后提取总RNA，构建文库，测序分析lncRNA和mRNA的表达谱。结果显示，与未感染组相比感染CVS11组有940个lncRNA出现差异表达，而感染SRV9组有946个lncRNA出现差异表达。在感染BHK21细胞的mRNA表达谱中，与未感染组相比感染SRV9病毒组有5984个mRNA出现差异表达，感染CVS11病毒组有5674个mRNA出现差异表达(P＜0.05)。GO富集分析显示，在CVS11组感染48h后，观察到lncRNA的靶基因对细胞应答、髓样树突细胞活化、巨噬细胞因子产生的调节和趋化因子受体活性的正调节显著富集，而在SRV9组感染48h后，lncRNA的靶基因对信号转导，蛋白激酶和胚胎形态发生的调节显著富集。KEGG富集分析结果显示CVS11组感染48h后，lncRNA靶基因有16个KEGG通路显著富集，其中包括涉及免疫应答的途径、病毒致癌作用、FoxO信号通路和MAPK信号通路等;在SRV9感染组中也观察到类似的结果。这些发现表明lncRNA在RABV感染期间调节免疫反应，通过调节其邻近的蛋白质编码基因来对病毒感染作出反应。本研究选取了差异表达lncRNA和mRNA进行了RT-qPCR验证。
　　其次利用CVS11狂犬毒株感染小鼠脑组织，在感染第八天发病时取小鼠脑组织，提取总RNA，构建文库，测序分析lncRNA和mRNA的表达谱。结果表明，与未感染组相比CVS11感染组共有140个lncRNA差异表达。染色体7号，12号和16号的lncRNA差异变化最大;染色体18号，19号和染色体X的lncRNA差异变化最小。同时检测了CVS11毒株感染小鼠脑组织后mRNA的表达谱变化，结果表明，与未感染小鼠相比CVS11感染组有3807个lncRNA差异表达基因(FC≥2，P＜0.05)。染色体2号，7号和11号mRNA差异表达最显著，染色体16号和18号mRNA差异较为显著。GO分析表明lncRNA上游或下游100kb的位置同位基因编码蛋白高度富集。差异表达的lncRNA共定位的基因高度富集在如氮化合物的解毒、氮化合物的细胞解毒和硝基苯的代谢过程等生物过程中。KEGG分析结果显示，差异表达的lncRNA靶点参与Toll样受体、NF-κB、MAPK、趋化因子、单纯疱疹和流感A感染等重要信号通路。这些发现表明lncRNA在RABV感染期间参与调节免疫反应。随后进行实时定量PCR验证差异表达，结果显示与小RNA测序分析RABV感染后差异表达一致。
　　本研究通过RABV感染细胞和小鼠，分别在体外和体内水平分析lncRNA和mRNA表达谱变化，并选择差异表达lncRNA和mRNA进行RT-qPCR验证。基于生物学信息分析，在体外和体内水平初步明确RABV感染诱导宿主的免疫应答路径。目前，尚未见RABV感染宿主lncRNA表达谱变化的研究。本研究为阐述RABV的免疫逃逸机制和致病机理提供数据支持。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 狂犬病概述

1．1．1 传播途径

1．1．2 发病机理

1．2 RABV概述

1．2．1 RABV病原学特征

1．2．2 病毒蛋白及其功能

1．3 RABV与宿主免疫应答

1．4 lncRNA概述

1．4．1 lncRNA生物学特征及分类

1．4．2 lncRNA作用机制及生物学功能

1．4．3 lncRNA检测技术

1．5 lncRNA与病毒感染

1．6 lncRNA(ncRNA)与狂犬病

1．7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验仪器与耗材

2．1．2 引物序列

2．1．3 实验动物

2．1．4 细胞

2．1．5 毒株

2．2 实验方法

2．2．1 RABV感染BHK21细胞的lncRNA和mRNA差异表达分析

2．2．2 RABV感染小鼠脑组织lncRNA和mRNA差异表达分析

3 实验结果

3．1 RABV感染BHK21细胞的lncRNA和mRNA差异表达分析

3．1．1 TCID50法测定RABV滴度

3．1．2 RNA测序鉴定差异表达的lncRNA

3．1．3 各组间BHK21细胞中mRNA的差异表达

3．1．4 lncRNA和mRNA在感染细胞中基因组结构特征

3．1．5 RABV诱导基因的功能预测

3．1．6 RT-qPCR验证

3．2 RABV感染小鼠脑组织lncRNA及mRNA差异表达分析

3．2．1 TCID50法测定RABV滴度

3．2．2 RNA测序鉴定差异表达的lncRNA

3．2．3 小鼠脑组织中mRNA差异表达变化

3．2．4 lncRNA和mRNA在小鼠中的基因组特征

3．2．5 RABV诱导差异表达的lncRNA功能预测

3．2．6 RT-qPCR验证

4 讨论

4．1 狂犬病现状

4．2 狂犬病毒致病机理现状

4．3 lncRNA与病毒感染

4．4 lncRNA在诊疗中的作用

4．5 展望

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文