穿心莲内酯对猪链球菌生物被膜QS系统及毒力因子的影响

摘要

为了探究穿心莲内酯对猪链球菌生物被膜形成的抑制作用及其相关机制，试验选取猪链球菌2型，利用盖玻片碎片法建立体外生物被膜模型，结晶紫染色(CV)和扫描电镜(SEM)检测猪链球菌生物被膜。采用细胞培养板体外培养猪链球菌，在96孔板内采用二倍稀释法测定穿心莲内酯对猪链球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。革兰氏阴性菌和阳性菌中普遍存在一种密度感应系统被称为LuxS/AI-2型密度感应系统，这种系统可以产生一种信号诱导分子被用来进行细菌种间的交流，此种信号分子在多种生理功能中都起到了重要的作用;运用哈维弧菌生物发光法对AI-2信号分子进行测定:通过qPCR检测密度感应系统（QS系统）中相关基因lasR和rhlR，以及调节基因pvdQ和毒力基因gapdh，sly，fbps，ef, gdh，mrp，cps2J，luxS的mRNA水平差异。 结果: (1)结晶紫染色结果显示:穿心莲内酯在亚抑菌浓度下(1/2 MIC，1/4 MIC，1/8MIC)能使细菌生物被膜形成量减少，并呈剂量依赖性，扫描电镜观察可见阴性对照组细菌镶嵌于生物被膜中，这与结晶紫染色结果一致; (2)穿心莲内酯对猪链球菌的MIC和MBC分别为0.25 mg· mL-1和0.5mg·mL-1; (3)哈维弧菌生物发光法测定细菌培养液显示穿心莲内酯在亚抑菌浓度下(1/2 MIC，1/4 MIC，1/8 MIC)对猪链球菌AI-2信号分子的产生有抑制作用，呈剂量依赖性; (4)LuxS基因和毒力基因的qPCR检测显示亚抑菌浓度(1/2 MIC，1/4 MIC)的穿心莲内酯明显降低gapdh，sly，fbps，ef和luxS基因的转录，显著增加cps2J，mrp和gdh基因的转录;穿心莲内酯在1/2 MIC浓度时能增加lasR基因的转录，1/4 MIC、1/8MIC浓度时其转录水平下降，穿心莲内酯在1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC浓度时都可以使rhlR和pvdQ的基因转录水平下降。 结论: 本研究使用盖玻片碎片法成功构建了猪链球菌体外生物被膜模型，结晶紫染色法和扫描电镜证明了穿心莲内酯对猪链球菌生物被膜形成具有干预作用;采用qPCR技术从转录水平验证了穿心莲内酯对生物被膜、QS系统和毒力因子的影响。 结果显示:亚抑菌浓度(1/2 MIC，1/4 MIC)的穿心莲内酯明显降低gapdh，sly，fbps，ef和luxS基因的转录水平，显著增加cps2J，mrp和gdh基因的转录;穿心莲内酯在1/2 MIC浓度时能增加lasR基因的转录，1/4 MIC、1/8 MIC浓度时其转录水平下降，穿心莲内酯在1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC浓度时都可以使rhlR和pvdQ的基因转录水平下降。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 猪链球菌的研究进展

1．1．1 病原学

1．1．2 流行病学

1．2 细菌生物被膜研究进展

1．2．1 细菌生物被膜的概述

1．2．2 细菌生物被膜结构特点

1．2．3 细菌生物被膜形成过程

1．3 猪链球菌生物被膜研究进展

1．3．1 猪链球菌2型的相关毒力因子

1．3．2 猪链球菌2型的其它相关毒力因子

1．4 细菌的QS系统对生物被膜的影响

1．5 穿心莲内酯的研究进展

1．5．1 药理作用

1．5．2 临床应用

1．6 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料及试剂

2．1．1 菌株

2．1．2 试剂

2．1．4 仪器

2．2 试验方法

2．2．1 穿心莲内酯对猪链球菌的MIC和MBC测定

2．2．2 猪链球菌生长曲线的测定

2．2．3 菌落计数法观察穿心莲内酯对猪链球菌数量的影响

2．2．4 穿心莲内酯干预猪链球菌培养对生物被膜形成影响

2．2．5 穿心莲内酯干预猪链球菌生物被膜形态的观察

2．2．7 16S以及lasR、rhlR和pvdQ基因上下游引物的设计

2．2．8 RNA提取和定量qPCR

2．2．9 数据处理

3 结果

3．1 穿心莲内酯抗猪链球菌的MIC和MBC

3．2 猪链球菌生长曲线

3．3 菌落计数法观察穿心莲内酯对猪链球菌数量的影响

3．4 穿心莲内酯对猪链球菌生物被膜的干预作用

3．5 穿心莲内酯干预猪链球菌生物被膜形态观察

3．6 猪链球菌生物被膜AI-2的测定结果

3．7 QS系检测结果

3．7．1 lasR基因相对定量实验结果

3．7．2 rhlR基因相对定量实验结果

3．7．3 pvdQ基因相对定量实验结果

3．8 毒力基因检测结果

4 讨论

4．1 生物被膜体外模型的建立

4．2 穿心莲内酯对生物被膜形成的影响

4．3 穿心莲内酯对S.suis毒力基因的影响

4．4 穿心莲内酯对QS系统及生物被膜的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文