三种肝片形吸虫诊断抗原的表达及ELISA诊断方法的建立

目录

声明

摘要

1引言

1．1肝片形吸虫与肝片形吸虫病

1．2肝片形吸虫病诊断方法研究进展

1．2．1常规诊断

1．2．2免疫学诊断

1．2．3血清酶学分析诊断

1．2．4分子生物学诊断

1．3肝片形吸虫诊断抗原研究概况

1．3．1组织蛋白酶L

1．3．2谷胱甘肽S-转移酶

1．3．3丝氨酸蛋白酶抑制剂

1．3．4亮氨酸氨基肽酶

1．3．5脂肪酸结合蛋白

1．3．6血红蛋白

1．4研究目的和意义

2材料与方法

2．1材料

2．1．1菌株和载体

2．1．2主要试剂

2．1．3试验动物及虫体

2．1．4主要仪器设备

2．1．5主要试剂的配制

2．1．6主要应用软件和数据分析

2．2方法

2．2．1引物的设计与合成

2．2．2肝片形吸虫总RNA的提取

2．2．3目的基因反转录

2．2．4目的基因克隆

2．2．5 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI克隆载体的构建

2．2．6 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI基因原核表达载体的构建

2．2．7 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI重组蛋白的诱导表达及纯化

2．2．8 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI重组蛋白免疫原性检测

2．2．9 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI重组蛋白的Western blotting分析

2．2．10 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI蛋白间接ELISA反应

2．2．11 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI蛋白间接ELISA条件优化

2．2．12 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI间接ELISA临界值确定

2．2．13敏感性试验

2．2．15特异性实验

2．2．16重复性试验

2．2．17样本检测

2．2．18统计分析

3结果

3．1 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI基因的扩增

3．2 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组克隆载体的双酶切鉴定

3．3 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组克隆载体的序列测序结果

3．3．3质粒pMD18-T-Fh SPI测序结果

3．4 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI基因表达载体的鉴定

3．4．1 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI重组表达载体的双酶切鉴定

3．4．2 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组表达载体的序列测定

3．5 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组蛋白的表达及纯化

3．6 pET-Fh Cat L、pET-Fh GST、pET-FhSPI重组蛋白诱导条件的优化

3．6．1 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组蛋白的IPTG诱导浓度的优化

3．6．2 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组蛋白诱导温度的优化

3．7 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组蛋白的纯化结果

3．8 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组蛋白的Western blotting分析

3．9 Fh Cat L、Fh GST、Fh SPI重组蛋白的免疫原性分析

3．10 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI蛋白抗原间接ELISA方法建立

3．10．1 Fh Cat L、Fh GST和Fh SPI蛋白间接ELISA方法优化

3．10．2间接ELISA方法阳性临界值的确定

3．10．3敏感性试验

3．10．4特异性实验

3．10．5重复性试验

3．10．6样本检测

4讨论

4．1目的基因的选择

4．2目的基因的克隆及重组蛋白的表达

4．3 ELISA条件的摸索

4．4 ELISA方法的临床应用

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文