ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用

摘要

水貂阿留申病(Aleutian Disease，AD)是由细小病毒亚科(Parvovirinae)阿留申水貂病毒属(Amdovirus)水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，ADV)引起的免疫系统病理性失调，是一种主要侵染水貂、病程缓慢的传染性疾病。该病以垂直和水平传播两种形式在世界各国的貂群中广泛流行，导致没有抗体的新出生幼貂的急性间质性肺炎甚至死亡，成年水貂的繁殖能力、皮张质量、健康状况下降以及死亡率增加，对水貂养殖业造成不可低估的经济损失。近年来，我国水貂养殖区阿留申病的流行情况在国内时有报道，高水平的AD感染一直是严重影响我国水貂养殖业高效、健康发展的一个非常重要的因素之一。由于目前针对该病缺少有效的防治方法，普遍采用的是通过定期检测，淘汰患病貂群，从而达到净化种群的目的。因此，在国内进行分离鉴定病毒株及进行分子生物学特性研究，建立国内适用的血清学诊断方法，将会对今后国内开展水貂阿留申病的临床诊断、有效防制及进一步的深入研究，提供更多的科学依据。 在本研究中，首先通过CIEP以及本实验室建立的ADV PCR检测方法，对黑龙江某水貂养殖场发病送检貂以及辽宁某水貂养殖区疑似阿留申病貂进行检测，将经两种方法检测均为阳性结果的毒株进行PCR扩增产物的序列测定，从中抽取序列较为保守的四株病毒与标准对照毒株进行序列比对和同源性分析，与ADV-G相应片段的核酸同源率分别为92.8％、93.9％、93.2％和93.5％，与参考株ADV-Utah的同源率分别为94.5％、98％、94.6％和95.5％，确定为ADV特异性核苷酸片段。依据鉴定的结果，成功鉴定了四株病毒，分别命名为MS-1、DL-1、DL-2和DL-3。 将MS-1、DL-1、DL-2和DL-3株病毒经组织病料提取总DNA，采用依据标准毒株ADV-G的DNA序列设计并合成的四对引物，经PCR扩增后分别构建重组质粒并测序，将测序结果用DNA Star软件中的SeqMan程序进行拼接，获得四株病毒的近全长DNA序列。用DNA Star软件MegAlign程序中的Jotun Hein method将实验测得的毒株与国外病毒参考株的对应核苷酸序列进行同源性比较和进化树分析。结果表明，ADV-Utah与四个实验毒株的序列同源性较高，同源率为92.9-93.4％，ADV-G、ADV-SL3与实验毒株的同源性较低；四个实验毒株和三个参考毒株被分别划归为两个组，分属于两个进化分支；实验毒株中ADV-DL1与DL2和DL3虽然同为大连分离株，却表现出较远的亲缘关系。用DNA Star软件MegAlign程序中的Clustal W method将实验测得的ADV毒株核苷酸序列、ADV参考株序列以及细小病毒其它四个属的代表毒株全序列进行进化树分析，发现14株病毒共划归为五个相对独立的进化分支，ADV与牛犬细小病毒作为细小病毒亚科中新增的属，与其它属的成员分属于不同的进化分支，分析结果验证了ICTV8公布的新分类体系的合理性。 选择VP2蛋白主要抗原表位区相对保守的ADV MS-1毒株作为种毒，分别设计合成两对引物，用PCR方法扩增其VP2基因中主要抗原表位区的两个片段，分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中，构建重组表达质粒pMAL-VP2a和pMAL-VP2b，经PCR扩增、酶切和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框正确，成功地构建了原核表达载体。阳性重组质粒转化宿主菌TB1，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段融合蛋白均以包涵体形式获得了有效表达，表达产物分别占总菌体蛋白的32.7％和37.41％；表达产物的分子质量分别约为63kD和65kD，与理论推测的分子质量一致；在终浓度为1mM的IPTG诱导下，4h时其表达量达到高峰；Westem blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别。将分离和初步纯化的表达包涵体蛋白作为抗原，对阳性血清进行CIEP检测，验证其免疫活性，并与标准抗原的CIEP检测结果相比较，二者的符合率达到94.3％。以本实验获得的重组蛋白作为诊断抗原的特异性、重复性、敏感性均较好，初步建立了临床诊断方法。总之，本研究对ADV国内分离毒株进行分离鉴定和全序列测定，为研究国内ADV病毒株的进化特点和规律提供基础性资料；在国内首次利用原核表达载体成功地对VP2主要抗原表位区进行表达，并以其为抗原，初步建立了ADV抗体的CIEP检测方法，将为国内养貂场有效开展阿留申病血清学调查提供有效的技术手段，在貂群的净化中发挥巨大的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1课题背景

1.2文献综述

1.2.1 ADV概述

1.2.2 ADV的分子生物学研究进展

1.2.3水貂阿留申病概述

1.3本课题的来源及主要内容

2 ADV的鉴定

2.1材料

2.1.1工具酶和试剂

2.1.2 CIEP检测用抗原及对照血清与PCR检测用对照毒株

2.1.3仪器

2.1.4试剂配制

2.1.5 PCR引物序列

2.2方法

2.2.1病料采集及处理

2.2.2流行病学及症状调查

2.2.3 CIEP检测

2.2.4 PCR检测

2.2.5 PCR产物的胶回收

2.2.6目的片段的克隆

2.2.7阳性重组子的筛选与鉴定

2.2.8目的基因序列的测定和序列分析

2.3结果

2.3.1流行病学和症状

2.3.2 CIEP检测结果

2.3.3 PCR检测结果

2.3.4序列分析结果

2.4讨论

2.5本章小结

3四株ADV近全长序列测定及遗传变异分析

3.1材料

3.1.1实验毒株与参考毒株

3.1.2质粒与菌种

3.1.3工具酶和试剂

3.1.4仪器

3.1.5 PCR引物

3.2方法

3.2.1 PCR扩增目的片段

3.2.2 PCR产物的胶回收

3.2.3目的片段的克隆

3.2.4阳性重组子的筛选与鉴定

3.2.5目的基因序列的测定

3.2.6序列分析

3.3结果

3.3.1 PCR扩增

3.3.2 PCR扩增产物的克隆、鉴定

3.3.3本实验测得毒株与ADV参考毒株的序列比对分析

3.3.4 ADV毒株与细小病毒亚科其它属代表毒株的序列比对分析

3.4讨论

3.4.1参考毒株的选择

3.4.2实验毒株与参考毒株之间的进化关系

3.4.3 ADV与其它各属成员的进化关系分析

3.5本章小结

4 VP2主要抗原表位的表达及表达产物的抗原性检测

4.1材料

4.1.1病毒株

4.1.2菌种和质粒

4.1.3工具酶

4.1.4 CIEP检测用抗原与血清

4.1.5试剂

4.1.6 SDS-PAGE使用试剂配置

4.1.7 Western-blot试剂配置

4.1.8仪器

4.1.9引物

4.2方法

4.2.1 VP2a及VP2b的PCR反应

4.2.2 PCR扩增目的片段的纯化

4.2.3 VP2a及VP2b片段与pMD18-T simple载体的连接和转化

4.2.4 pMD18-T阳性重组子的鉴定

4.2.5 pMD18-T阳性重组子序列的测定

4.2.6原核表达载体pMAL-VP2a及pMAL-VP2b的构建

4.2.7重组pMAL-VP2a及pMAL-VP2b表达质粒的转化和鉴定

4.2.8重组质粒pMAL-VP2a及pMAL-VP2b的序列测定及抗原表位分析

4.2.9阳性重组质粒转化TB1感受态细胞

4.2.10 pMAL-VP2a及pMAL-VP2b重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

4.2.11菌体裂解物的SDS-PAGE电泳及表达位置的确定

4.2.12诱导表达条件的优化

4.2.13表达产物Western blot分析

4.2.14包涵体蛋白的提取与纯化

4.2.15 CIEP检测

4.2.16表达蛋白与标准抗原CIEP检测结果的比较

4.3结果

4.3.1 VP2a及VP2b的PCR扩增结果

4.3.2重组质粒PMD18-T-VP2a及PMD18-T-VP2b的PCR与酶切鉴定

4.3.3重组质粒PMD18-T-VP2a及PMD18-T-VP2b的测序

4.3.4重组原核表达载体pMAL-VP2a和pMAL-VP2b的鉴定

4.3.5重组质粒pMAL-VP2a和pMAL-VP2b的序列测定

4.3.6 SDS-PAGE鉴定结果及重组蛋白最佳诱导条件的确定

4.3.7 Western blot分析

4.3.8纯化回收后蛋白的浓度测定结果

4.3.9 CIEP检测结果

4.3.10表达蛋白和标准抗原CIEP方法的比较试验结果

4.4讨论

4.4.1引物的设计

4.4.2目的片段的选择

4.4.3实验毒株的选择

4.4.4表达系统的选择

4.4.5重组表达载体的快速PCR鉴定

4.4.6目的片段与表达载体的连接

4.4.7表达产物的Western blot检测

4.4.8包涵体的形成与纯化

4.4.9本实验所建立的CIEP诊断方法的特点

4.5本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢