新城疫病毒不同毒株HN蛋白多肽片段的免疫原性差异比较分析

摘要

新城疫是由禽腮腺病毒属成员新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种禽的烈性、高度接触性传染病。随着缓发型病毒株以及经过精心筛选的某些中发型病毒株组成的新城疫活病毒疫苗的使用，ND的发生有了一定的缓解，但是ND疫苗并不能完全阻止新城疫的发生。目前，免疫鸡群发生新城疫流行的原因尚不明确，分析流行毒株的变异很可能是重要的原因之一。 从分子流行病学角度，可将新城疫病毒分为九个基因型，近年来我国ND的流行是由基因Ⅶ、Ⅸ、Ⅵ型病毒引起的，通过分析，基因Ⅶ型是最主要的流行毒株。基因Ⅶ型毒株在囊膜糖蛋白上，一些位点的氨基酸发生了特征性的改变，与以往的毒株特别是疫苗株相比，遗传距离越来越远。本研究通过比较NDV不同基因型毒株HN蛋白的氨基酸序列，发现基因Ⅶ型的毒株在第65～75位的氨基酸序列较为保守，而其他各基因型在该区域则不尽相同，这种序列上的差异是否与各基因型的免疫活性差异相关，还有待于进一步研究。因此，本研究分别克隆和表达了广西分离毒株GX-2(基因Ⅶ型)；中国标准强毒株F<,48>E<,9>(基因Ⅸ型)；La Sota疫苗株(基因Ⅱ型)；V<,4>疫苗株(基因Ⅰ型)；A<,4>鸽源毒株(基因Ⅵ型)的含有该差异的HN基因的部分序列，进行了体外表达与免疫原性分析，旨在探讨这种序列上的差异对不同NDV毒株的HN蛋白的影响，进而观察由此产生的不同毒株的免疫效果是否存在差异。 参考已知NDV HN的序列设计特异性引物，扩增含有这部分差异片段的基因。通过回收、酶切获得黏性末端，并将目的基因分别连接到原核表达载体pGEX-6p-1上，筛选的重组质粒分别命名为pGEX-GX-2、pGEX-F<,48>E<,9>、pGEX-La Sota、pGEX-A<,4>、pGEX-V<,4>，进行核苷酸序列测定。分别对每个测序鉴定为正确的重组载体进行蛋白表达。应用SDS-PAGE对表达情况进行电泳分析，结果表明表达蛋白约为39 ku，与预期结果大小一致。由于表达的肽段主要以包涵体的形式存在，因此我们又对重组蛋白进行纯化，用于不同毒株的免疫活性分析。应用所表达的重组蛋白进行了Western Blot活性检测，结果显示：融和蛋白pGEX-GX和融和蛋白pGEX-La反应程度较为接近，而融和蛋白pGEX-F的反应较前两者弱；融合蛋白pGEX-La和融合蛋白pGEX-V<,4>的反应程度接近。 为了比较各毒株的免疫原性差异，将纯化的各个毒株的重组蛋白和纯化的mChIL-18成熟肽蛋白以不同组合免疫SPF鸡，采集血清，利用ELISA检测不同免疫组的NDV特异性血清抗体效价，结果显示，各免疫组均可刺激产生一定效价的NDV特异性抗体，且抗体水平由高至低依次为pGEX-F<,48>E<,9>、pG-EX-GX-2、pGEX- La Sota、pGEX-A<,4>、pGEX-V<,4>；将鸡IL-18成熟肽分别与pGEX- F<,48>E<,9>和pGEX-GX-2进行联合免疫时，其免疫效果有所增强。以NDV F<,48>E<,9>强毒株攻毒结果显示，攻毒保护率为pGEX-F<,48>E<,9>>pGEX-GX-2>pGEX-La Sota>pGEX-A<,4>=pGEX-V<,4>，说明不同毒株的HN蛋白多肽对鸡群的保护力存在差异，提示我们不同毒株由于序列上的差异，使其存在明显的抗原性差异，免疫鸡群中ND的流行可能就是由于这种差异的累计而产生的。本研究中免疫保护率低可能存在以下原因：首先是表达肽段的选择问题，在选择表达区域时常常会遗失一些重要的抗原位点：其次是原核表达往往缺少糖基化过程及其他翻译后的修饰，这可能影响表达片段的抗原性；第三，重组蛋白的变性和复性后可能使其结构发生了变化，形成了部分折叠或错误折叠，从而影响了表达蛋白的免疫效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1引言

1.2新城疫病毒的一般特征

1.2.1新城疫病毒的分类地位、形态及理化特性

1.2.2 NDV的生物学活性

1.2.3 NDV的培养特性

1.2.4 NDV的致病性

1.3 NDV蛋白的分子结构及其与致病性的关系

1.3.1 NDV蛋白的分子结构

1.3.2 NDV致病性的分子基础

1.4 NDV的基因型

1.5 ND疫苗的研究进展

1.5.1常规疫苗

1.5.2利用反向遗传操作技术制备疫苗

1.5.3基因工程疫苗

1.6 IL-18作为佐剂的研究进展

1.7研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1病毒

2.1.2鸡胚和鸡

2.1.3菌种和质粒

2.1.4辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体

2.1.5 ELISA实验用抗原及血清

2.1.6主要试剂

2.1.7主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1病毒的培养

2.2.2 NDV RNA的提取

2.2.3 NDV F48E9、NDV GX-2、NDV La Sota、NDV A4、NDV V4株HN部分基因和mChIL-18 cDNA片段扩增、克隆和序列测定

2.2.4 NDV F48E9、NDV GX-2、NDV La Sota、NDV A4、NDV V4株HN部分基因和mChIL-18成熟肽蛋白的表达

2.2.5纯化多肽的免疫活性检测

实验技术路线

3实验结果与分析

3.1 NDV各毒株HN部分基因及mChIL-18片段的扩增

3.2 NDV各毒株HN部分基因及mChIL-18基因原核表达载体的构建

3.3目的蛋白的表达及抗原性分析

3.3.1目的蛋白的表达及鉴定

3.3.2目的蛋白最佳表达条件的优化

3.3.3目的蛋白的纯化

3.3.4目的蛋白的Western Blot活性检测及比较

3.3.5间接ELISA检测纯化多肽的免疫原性检测及活性比较

4讨论

4.1实验毒株的选择依据

4.2 NDV各毒株的HN部分基因及mChIL-18的克隆与序列分析

4.2.1 NDV 5毒株的HN部分基因的序列分析

4.2.2表达载体的选择

4.3 NDV各毒株的HN部分基因及mChIL-18基因目的蛋白的获得

4.3.1诱导表达条件的选择

4.3.2表达蛋白的纯化与复性

4.4 Western Blot活性鉴定

4.5免疫活性鉴定

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢