马鹿精子体外获能与评价体系及其体外受精的研究

摘要

精子获能(sperm capacitation)是正常受精必须经过的生理过程。对精子获能及相关问题的研究自然成为生殖生物学领域不可或缺的部分。本研究以马鹿为试验对象，对精子在体外获能(sperm in vitro capacitation)及项体反应(acrosome reaction，AR)过程中各种影响因素的作用进行了分析，从而筛选出了一套在实践中具有可操作性的马鹿精子体外获能培养体系和快速、准确评价精子获能水平的方案；在这些研究的基础上，进一步对马鹿体外受精(in vitro fertilization，IVF)和马鹿精子体外获能与AR中形态学、生理学变化进行了研究，旨在为鹿体外受精的深入研究提供思路，为生殖生物学等相关学科的基础理论研究提供数据和资料。 对马鹿精子体外获能培养体系和评价体系的研究结果表明： 1、温度对马鹿精子体外获能有显著的影响。低于马鹿体温的 37℃和37.5℃不利于马鹿精子获能(P<0.05)；适宜的体外获能温度范围为 38～39.5℃；其中38.5℃时的获能效果最好。 2、上浮法、孵育法和Percoll不连续梯度密度离心法均可使马鹿精子体外获能；但综合精子活力、弯尾率、AR率等指标，上浮法最优。 3、鲜精与冻精均可在体外条件下被诱导获能。应用冻精后的异种穿卵率、AR 率、活力和弯尾率均低于鲜精，但经比较，差异均不显著(p>0.05)。 4、培养基中Ca<'2+>、Mg<'2+>、K<'2+>、葡萄糖和丙酮酸钠的浓度都会影响到马鹿精子体外获能的水平。应用修正后的BO液培养马鹿精子，获能水平有显著的提高(p<0.05)：但应用高离子强度液(high ionic strength medium，HIS)却未获得较好的获能效果(p<0.01)。 5、血清与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)使用的种类不同、浓度不同均可影响马鹿精子体外获能的效果。10％公马鹿血清、15％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)、6mg/mlBSA 和 9mg/mlBSA 的使用效果较好，AR 率均达到 69.0％以上；培养液中BSA或FBS的浓度过高反而使获能水平下降。 6、肝素的使用浓度和作用时间直接影响到马鹿精子体外获能的水平。0～200μg/ml的肝素中，对马鹿精子体外获能的适宜作用范围是20～30μg/ml(p<0.05)，其中以20μg/ml为最佳；在肝素浓度为20μg/ml时，处理时间0～120min中以15min为最佳(p<0.05)；延长作用时间并未提高获能效果。 7、孕酮(progesterone，P<,4>)、γ-氨基于酸(γ-aminobutyricacid，GABA)、钙离子载体A23187(calcium ionophore A23187，A23187)和钾离子载体缬安霉素(valinomycin，Val)均可于体外诱导马鹿获能精子AR；其最佳使用浓度和作用时间的组合分别为P<,4> 10μmaol/L×10min、GABA 0.5mmol/L×10min、A23187 0.1μmol/L×5min、Val 0.5μmol/L×5min，所获得AR率均在70％以上，其中以P4组的AR率为最高(78.4±4.3％)。 8、以异种穿卵率(SPA值)为主要指标对比电子显微镜法(technique for electronmicroscopy，TEM)、三色染色法(triple-stain technique，TST)和考马斯亮蓝染色法(eoomassie brilliant blue smining，CBB)对马鹿精子获能水平的评价效果，结果只有TST的结果与异种穿卵试验(sperm penetration of zona-free hamster egg assay，SPA)的结果一致；TEM法和CBB法的结果相似；在实践中SPA法对技术要求高，且无法一人独立完成，TST法具有简便易行和相对省时的优点。 9、所筛选的马鹿精子体外获能培养体系为：应用修正后的BO基础液，添加6mg/mlBSA，使用上浮法，以肝素(20μg/ml，作用15min)诱导马鹿精子体外获能，培养条件为38.5℃、5％CO<,2>，饱和湿度。经比较，应用该体系可显著提高SPA值和AR率(p<0.01)。 10、所筛选的马鹿精子体外获能评价体系为：用P<,4>(10grnol/L×10min)对马鹿获能精子进行AR诱导，TST法评价顶体状态，辅以精子活力和弯尾率等指标，必要时再辅以SPA法。 应用上述马鹿精子体外获能培养体系进行马鹿体外受精研究，结果表明： 1、M199成熟液中FBS的浓度为10％、20％或用10％自制成年母鹿血清取代FBS，均可使马鹿卵子体外成熟(in vitro maturation，IVM)及体外受精，成熟率和受精率的差异均不显著(p>0.05)；在受精卵早期培养中，存在20％FBS时获得了较高的 2-细胞比率(p<0.05)。 2、应用输卵管上皮细胞单层(oviduct epithelial cell monolayers，COEM)共培养体系进行马鹿的体外受精及受精卵的发育培养，结果获得了60.0％的受精率，有66.7％的受精卵发生了卵裂，并有卵子发育至 4-细胞阶段。对照组中受精卵只发育至 2-细胞期，无卵子继续发育至4-细胞。 使用电感耦合等离子体发射光谱仪(inductive coupled plasma，ICP)与离子色谱仪，对马鹿精子体外获能和AR过程中培养液内Ca<'2+>、Mg<'2+>、Na<'+>、K<'+>、CI<'->和总P的浓度进行检测，结果表明：在马鹿精子体外获能与AR过程中，这些离子均发生了浓度上的变化，精子细胞内外存在着离子的跨膜运动。对体外获能前后以及精液冷冻处理前后马鹿精子形态上变化的研究结果表明： 1、马鹿精子与其他哺乳动物相似，在电镜下，由头部、颈部和尾部3部分组成。头部呈扁卵圆形，主要由精核构成，在其上有似帽状的顶体，顶体前端下折产生象鼻样下垂；颈部脆弱，尾部易从此处脱落；尾部由中段、主段和末段组成，轴丝的结构类型为“9+2”。 2、电镜下观察，马鹿精子获能前，头部质膜和顶体完整；精子获能后，质膜膨胀，甚至断裂或丢失，顶体外膜以多种方式发生了囊泡化，进而顶体内膜裸露。 3、电镜下观察，马鹿精子冷冻后，31.7±5.2％的质膜有膨胀现象出现；顶体的损伤较小，只有个别发生与获能组相似的顶体反应，比率为4.6±3.8％；解冻后精子体外获能，所观察到的超微结构变化与鲜精组基本相同。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1绪论

1.1引言

1.2什么是精子获能与AR

1.3精子获能的研究方法

1.4精子体外获能的影响因素

1.4.1温度

1.4.2 pH和渗透压

1.4.3精子体外获能方法

1.4.4动物种类

1.4.5精液来源

1.4.6培养基成分

1.5精子获能的评价

1.5.1 HAM

1.5.2AR

1.5.3 SPA

1.6 AR的诱导因子

1.6.1 P4

1.6.2 GABA

1.6.3 A23187

1.6.4 Val

1.6.5其他

1.7 AR评价方法

1.7.1 TEM法

1.7.2相差显微镜检查法

1.7.3 TST法

1.7.4 CBB法

1.7.5 CTC法

1.7.6 Hoechst与特异植物凝集素结合法

1.7.7顶体酶释放检测法

1.8精子获能与AR中的生理学变化

1.8.1精子获能期间胞内离子的变化

1.8.2AR过程中胞内离子的变化

1.9精子获能与AR中的形态学变化

1.10卵母细胞体外成熟与体外受精

1.10.1卵母细胞的成熟机理

1.10.2卵母细胞的收集

1.10.3卵母细胞体外成熟的影响因素

1.1 0.4精子体外获能

1.10.5体外受精与受精卵的体外培养

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1精液来源

2.1.2试验动物来源

2.1.3主要仪器设备

2.1.4主要试剂和药品

2.1.5主要操作用液

2.2精子体外获能

2.2.1诱导精子体外获能的方法

2.2.2诱导获能精子发生AR的方法

2.2.3精子质量检测和获能水平的评价方法

2.2.4实验设计

2.3体外受精

2.3.1体外受精程序

2.3.2 COEM的制备方法

2.3.3实验设计

2.4体外获能与AR过程中生理学变化

2.4.1离子的检测方法

2.4.2实验设计

2.5体外获能与AR过程中形态学变化

2.5.1电子显微镜检查样本的制备方法

2.5.2精子的测量方法

2.5.3实验设计

3试验结果

3.1马鹿精子体外获能培养体系的筛选

3.1.1评价马鹿精子体外获能方法的筛选

3.1.2诱导马鹿获能精子发生AR的方法

3.1.3温度对马鹿精子体外获能的影响

3.1.4培养方法对马鹿精子体外获能的影响

3.1.5鲜精与冻精在马鹿精子体外获能中的差异

3.1.6培养基中几种离子和能源物质浓度对马鹿精子体外获能的影响

3.1.7 BSA和血清对马鹿精子体外获能的影响

3.1.8肝素对马鹿精子体外获能的影响

3.1.9马鹿精子体外获能最佳培养体系

3.2马鹿体外受精研究

3.2.1血清对体外受精的影响

3.2.2 COEM对体外受精的影响

3.3马鹿精子体外获能与AR过程中的生理学变化

3.3.1 Ca2+变化

3.3.2 Mg2+变化

3.3.3 Na+变化

3.3.4 K+变化

3.3.5 Cl-变化

3.3.6总P变化

3.4马鹿精子体外获能与AR过程中的形态学变化

3.4.1正常马鹿精子形态

3.4.2马鹿精子获能前后的形态学变化

3.4.3马鹿精子冷冻前后的形态学变化

4分析与讨论

4.1马鹿精子体外获能培养体系

4.1.1温度

4.1.2获能方法

4.1.3鲜精与冻精

4.1.4体外获能培养基

4.1.5 BSA与血清

4.1.6肝素

4.2马鹿精子体外获能评价体系

4.2.1精子获能的评价

4.2.2 AR诱导因子

4.3马鹿体外受精研究

4.3.1血清对体外受精的影响

4.3.2 COEM对体外受精的影响

4.4马鹿精子体外获能与AR过程中的生理学变化

4.4.1 Ca2+

4.4.2 Mg2+

4.4.3 Na+

4.4.4 K+

4.4.5Cl-

4.4.6P

4.5马鹿精子体外获能与AR过程中的形态学变化

4.5.1马鹿精子形态结构特点与其机能的关系

4.5.2马鹿精子体外获能后超微结构变化及其机制探讨

结论

参考文献

附图

攻读学位期间发表的学术论文

致谢