干旱胁迫下黄檗消减文库的构建及Ⅱ型MT基因的克隆

摘要

黄檗是古热带区孑遗植物，经历了从第三纪炎热到寒冷等一系列的气候变迁，对自然界的非生物胁迫(如高温、干旱、寒冷)有很强的适应力，为国家二级保护植物。 为研究干旱胁迫下黄檗的基因表达情况，本论文以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA为tester，正常生长的黄檗幼苗组织cDNA为driver，利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆，提取质粒进行酶切和PCR鉴定，显示文库克隆的重组率大于95％，插入片段大部分集中在300～800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序，得到265个基因。将其进行同源性分析，将其划分为16类，获得了如热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MT2)，晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因，它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。所得160个EST序列已被GenBank和EST数据库收录。 从文库中选取金属硫蛋白基因(MT2)进一步研究，根据测序得到的序列设计MT2特异性引物，通过5’cDNA末端快速扩增(RLM-RACE)技术克隆了其5’端序列。将5’RACE产物克隆入pGEM-T载体后，转化测序，并根据测序结果重新设计引物，克隆了MT2编码区序列，从而得到了MT2的全长序列。黄檗MT2基因mRNA全长852bp，ORF分析表明，其在112bp处具有起始密码子ATG，315bp处有终止密码子TGA，具有240bp的完整的开放读码框，预测编码79个氨基酸。经过Blast分析，发现它在核酸序列上与柑橘、柳树类MT序列有80％的序列同源性，且同源区域覆盖cDNA100％；其假定氨基酸序列与柳树类MT2A蛋白在55个氨基酸序列中有70％的同源性，说明黄檗金属硫蛋白与已知MT有明显的同源性，可以预测其具有与己知MT类似的功能。 综上所述，利用SSH技术构建了黄檗幼苗在干旱胁迫下差异表达基因文库，通过生物信息学分析研究了干旱胁迫过程中相关基因的表达情况，克隆了金属硫蛋白基因的全长序列，为进行黄檗分子生物学的研究奠定了基础，同时为植物基因工程提供了丰富的抗逆基因。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1黄檗的研究现状

1.2植物抗旱基因工程研究进展

1.2.1植物应对干旱的生物学反应

1.2.2干旱胁迫下植物的代谢调节网络

1.3抑制性消减杂交技术(SSH)简介

1.3.1抑制性消减杂交的原理与实验过程

1.3.2 SSH技术的优点和主要缺陷

1.4 cDNA末端快速扩增技术简介(RACE)

1.4.1 RLM-RACE的基本原理

1.4.2 RACE技术的优点和缺点

1.4.3 PCR扩增过程的优化

1.5论文主要内容和研究意义

1.5.1主要研究内容

1.5.2研究意义

2黄檗cDNA消减文库的构建

2.1实验材料和试剂

2.1.1实验材料

2.1.2主要试剂

2.1.3主要引物序列

2.2实验过程

2.2.1水势的测定

2.2.2黄檗总RNA的提取

2.2.3黄檗mRNA的分离

2.2.4抑制性消减文库的构建

2.2.5文库的转化和阳性克隆鉴定

2.2.6文库的测序和EST生物信息学分析

2.2.7 EST序列提交Genbank

2.3实验结果与分析

2.3.1叶片水势的测定结果

2.3.2黄檗总RNA和mRNA的提取

2.3.3双链cDNA的合成与Rsa Ⅰ酶切效率分析

2.3.4消减杂交后两轮PCR扩增产物结果分析

2.3.5文库的质量分析

2.3.6 EST序列的同源性分析

2.3.7序列提交Genbank

2.4本章小结

3 RACE技术克隆金属硫蛋白基因全长序列

3.1实验材料与试剂

3.1.1实验材料

3.1.2主要试剂

3.1.3引物序列

3.2实验过程

3.2.1 MT基因特异性引物设计

3.2.2黄檗总RNA提取及mRNA纯化

3.2.3 mRNA脱磷酸化

3.2.4 mRNA帽子结构的去除

3.2.5 mRNA与RNA Oligo的连接

3.2.6 mRNA的反转录

3.2.7 MT 5'末端PCR扩增

3.2.8 5'RACE产物的克隆、筛选和测序

3.2.9 MT cDNA序列克隆

3.2.10 MT序列的生物信息学分析

3.3实验结果与讨论

3.3.1 MT基因特异性引物设计

3.3.2总RNA提取和mRNA纯化

3.3.3 5'RACE的扩增

3.3.4 5'RACE产物的克隆、筛选

3.3.5 cDNA序列的克隆

3.3.6全长序列的拼接、ORF分析

3.3.7 BLAST分析

3.3.8氨基酸序列同源性比对分析

3.3.9进化树分析

3.4本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢