蝎神经性毒素ANEP、AGAP的原核表达及毒力测定

摘要

由于人类不合理的经营，常常导致森林病虫害周期性大发生，不仅给林业生产带来巨大的经济损失，而且还威胁着生态平衡。在森林害虫防治中以往多采用化学药剂，长期使用化学防治不仅导致害虫产生耐药性，而且用药量越来越大，形成恶性循环，对自然生态平衡造成严重的破坏，直接威胁着人、畜的安全，同时也增加了防治难度和资金的投入。
　　抗病虫基因工程的发展为防治病虫害开辟了一条新途径，对于植物的保护作用具有持续性，大大降低了病虫害的抗药性和对环境的污染，有效维护了生物多样性和生态平衡。
　　本文对东亚钳蝎昆虫毒素ANEP、AGAP在大肠杆菌BL-21中的最佳表达条件以及两种蝎神经性毒素实验室毒力测定进行研究，得出实验结果如下：
　　1.重组蛋白ANEP的理论分子量为15169.572 Da，Ala、，Cys、Gly和Thr分别占31.25％、13.02％、29.68％、26.04％; AGAP的理论分子量为15786.402 Da，其中Ala占30.3％，Cys占15.15％，Gly占28.78％，Thr占25.75％。
　　2.利用琼脂糖凝胶电泳对重组菌进行筛选，得到分布在标准DNA片断100bp到250bp之间的扩增基因条带，重组质粒成功转化到表达菌体中。
　　3.通过均匀设计实验，得出蝎神经性毒素ANEP最佳表达条件为:表达时间6h，诱导物浓度1mmol/L，菌液比例1:50，菌液OD值0.7;得出蝎神经性毒素AGAP的最佳表达条件为:表达时间6h，诱导物浓度0.5mmol/L，菌液比例1:100，菌液OD值0.5。
　　4.蝎神经性毒素ANEP200倍稀释液对于分月扇舟蛾，榆紫叶甲，落叶松毛虫的校正死亡率分别为84.48％，79.31％，83.05％;蝎神经性毒素AGAP200倍稀释液对于分月扇中蛾，榆紫叶甲，落叶松毛虫的校正死亡率分别为82.76％，68.97％，81.36％。
　　5.2种蝎神经性毒素重组蛋白对3种森林害虫均具有一定的杀虫效果，但ANEP杀虫效果均好于AGAP。AGAP对分月扇舟蛾的效果最佳，5种浓度的幼虫死亡率为51.72％-84.48％，对榆紫叶甲幼虫的毒力最差。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．1．1 蝎神经性毒素的研究进展

1．1．2 蝎昆虫毒素在生物防治上的研究

1．1．3 蝎昆虫毒素的作用机理与分类

1．1．4 表达载体pJUTRX

1．1．5 基因衰达类型

1．1．6 基因表达系统

1．1．7 抗神经兴奋肽ANEP

2 重组质粒的原核表达

2．1 试验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 细菌LB培养基

2．1．3 氨苄青霉素(100mg／ml)

2．1．4 主要溶液试剂

2．1．5 主要仪器设备

2．2 技术路线与试验方法

2．2．1 试验路线

2．2．2 感受态细胞的制备

2．2．3 重组质粒转化大肠杆菌BL-21

2．2．4 重组质粒的小量制备

2．2．5 重组菌的筛选

2．2．6 重组蛋白的表达

2．2．7 重组蛋白襄达条件优化设计

2．2．8 SDS-聚丙烯凝胶电泳分析诱导时间过程及表达量

2．2．9 Antheprot蛋白质分析

2．2．10 BandScan分析目的蛋白表达量

2．3 结果与分析

2．3．1 Antheprot蛋白分子量

2．3．2 重组质粒转化大肠杆菌BL-21

2．3．3 PCR扩增结果

2．3．4 重组蛋白表达结果与SDS-聚丙烯凝胶电泳分析

2．3．5 重组蛋白最佳表达条件

2．4 本章小结

3 蝎昆虫毒素的毒力

3．1 试验材料与设备

3．1．1 试验主要材料

3．1．2 试验试剂

3．1．3 供试昆虫

3．2 试验方法

3．2．1 目的蛋白的大量表达

3．2．2 目的蛋白的裂解

3．2．3 毒力测定

3．2．4 试验数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 对分月扇舟蛾幼虫的毒力

3．3．2 榆紫叶甲的毒力测定

3．3．3 落叶松毛虫幼虫毒力测定

3．3．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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