木蹄层孔菌漆酶的产生、分离纯化及酶学性质研究

摘要

本文通过对东北林业大学微生物及免疫学实验室保存的27株（种）大型真菌木素氧化酶系组成、活性及对染料脱色作用的研究，筛选出木蹄层孔菌作为产漆酶的菌株。并进一步对该菌产漆酶发酵条件、漆酶的纯化及酶学性质进行了研究。获得如下结果:
　　(1)米用丁香醛连氮、苯胺蓝平板脱色等4种方法，定性检测了株（种）大型真菌的木素氧化酶系组成。结果表明5个菌种同时具有Lac、Lip、Mnp3种酶的活性，5个菌种同时具有Lac、LiP2种酶的活性，8个菌种具有1种酶的活性;12个菌种具有漆酶活性。选择其中生长速度快、漆酶活性高的5个菌种进行漆酶产生的研究，发现木蹄层孔菌在诱导、静止培养条件下产生的漆酶酶活峰值高达9496 U/mL，远远高于其它已报道过的菌种，说明木蹄层孔菌静止培养可代替振荡培养进行漆酶产生的后续研究。木蹄层孔菌等5种真菌对刚果红等4类染料均具有高效广谱的脱色作用，其中木蹄层孔菌效果最好。
　　(2)利用正交实验对木蹄层孔菌产漆酶发酵条件进行研究，得到优化培养基组成为(/L):淀粉20 g;藜芦醇2.5 g;蛋白胨2.5 g;Tween800.15％; CuSO40.1 mM（调节pH至4.0，温度为30℃）。
　　(3)通过DEAF-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤等纯化技术对木蹄层孔菌胞外漆酶进行了纯化，最终纯化倍数达11.93，回收率为20.18％。
　　(4)以ABTS作为底物时木蹄层孔菌纯化后的漆酶的最适pH为2.8，在pH2.0～5.0之间维持较高的酶活，超过pH5.0漆酶活性急剧下降;纯化后的漆酶最适反应温度为60℃，在20～65℃范围内较稳定，超过65℃酶活力下降迅速。纯化后的漆酶对底物ABTS的催化效率较高，米氏常数为0.068 mmol/L。几种漆酶的抑制剂中的NaN3、半胱氨酸和DTT对漆酶活力有强烈的抑制，而金属离子鳌合剂EDTA对漆酶活力的抑制程度较低。Zn2+、Mg2+、Ca2+等金属对漆酶活性有明显的激活作用。染料降解实验发现木蹄层孔菌与染料的共培养体系、木蹄层孔菌纯化后的漆酶均对偶氮类染料刚果红、三苯甲烷类染料结晶紫、杂环类染料亚甲基兰、蒽醌类染料茜素红四类染料有很高的降解作用。显示了木蹄层孔菌及其所产生的漆酶在染料降解的应用上具有很强的工业应用潜力。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．1．1 白腐菌

1．1．2 木蹄层孔菌

1．1．3 漆酶

1．2 漆酶的理化性质

1．2．1 漆酶催化反应机理

1．2．2 漆酶底物的专一性

1．3 漆酶的应用

1．3．1 造纸工业中的应用

1．3．2 食品工业中的应用

1．3．3 环境保护中的应用

1．3．4 生物检测中的应用

1．4 国内外漆酶发酵条件的研究

1．5 国内外漆酶蛋白纯化及酶学性质的研究

1．6 本课题来源及研究目的和意义

1．6．1 本课题来源

1．6．2 研究目的和意义

2 高产漆酶菌株的筛选

2．1 材料

2．1．1 菌种来源

2．1．2 增养基

2．1．3 药品

2．1．4 仪器

2．2 方法

2．2．1 丁香醛连氮法定性检测木素氧化酶系

2．2．2 苯胺蓝平板脱色法定性检测过氧化物酶(LiP+MnP)

2．2．3 亚甲基蓝(MB)法定性检测木素过氧化物酶(LiP)

2．2．4 愈创木酚法定性检测锰过氧化物酶(MnP)

2．2．5 种子母液的培养

2．2．6 发酵液的培养方式

2．2．7 漆酶活性的定量测定

2．2．8 共培养体系对染料的脱色作用

2．2．9 脱色率检测方法

2．3 结果与分析

2．3．1 木素氧化酶系的定性检测

2．3．2 培养方式对白腐菌漆酶产生的影响

2．3．3 白腐菌对种染料脱色作用

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 木蹄层孔菌产漆酶发酵条件的研究

3．1 材料

3．1．1 菌种来源

3．1．2 培养基

3．1．3 药品

3．1．4 仪器

3．2 方法

3．2．1 培养方法

3．2．2 漆酶活性测定

3．2．3 正交实验

3．3 结果与分析

3．3．1 低碳培养基正交优化

3．3．2 高碳培养基得正交优化

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 木蹄层孔菌漆酶纯化方法的研究

4．1 材料

4．1．1 菌种来源

4．1．2 培养基

4．1．3 药品

4．1．4 仪器

4．2 方法

4．2．1 培养方法

4．2．2 样品的制备

4．2．3 漆酶活性测定及蛋白含量测定

4．2．4 纯化步骤

4．3 结果与分析

4．3．1 离子交换层析上样缓冲体系pH的选择

4．3．2 离子交换层析离子强度的选择

4．3．3 漆酶纯化结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

5 木蹄层孔菌漆酶酶学性质的研究

5．1 材料

5．2 方法

5．2．1 漆酶活性测定

5．2．2 凝胶电泳

5．2．3 pH值对漆酶活性的影响

5．2．4 温度对漆酶活性的影响

5．2．5 pH及温度对漆酶稳定性的影响

5．2．6 金属离子对漆酶活性的影响

5．2．7 抑制剂对漆酶活性的影响

5．2．8 漆酶米氏常数的测定

5．2．9 漆酶对染料的脱色作用

5．3 结果与分析

5．3．1 凝胶电泳

5．3．2 pH对漆酶活性的影响

5．3．3 温度对漆酶活性的影响

5．3．4 pH及温度对漆酶稳定性的影响

5．3．5 金属离子对漆酶活性影响

5．3．6 抑制剂对漆酶活性的影响

5．3．7 米氏常数的测定结果与分析

5．3．8 漆酶对染料的降解实验结果和分析

5．4 讨论

5．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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