基于改进的高通量酵母双杂交技术平台研究人类肝脏重要蛋白质的相互作用

摘要

肝脏是人体最大的代谢器官，在人体中具有不可替代的重要生理功能。研究肝脏内重要蛋白质的相互作用是理解肝脏生理功能与分子机制的基础。本论文利用改进的高通量酵母双杂交技术平台来研究人肝脏重要蛋白质的相互作用，为初步描绘人类肝脏重要蛋白质相互作用连锁图打下了一定的基础。其内容主要有以下几个方面：(1)酵母双杂交诱饵载体pDBlg的构建：最初的双杂交系统是invitrogen公司的PROQUSTTMTwo-hybridsystem，在此将其诱饵载pDBLeu载体作出了改进：在其多克隆位点处引入两个识别位点不一样的Bsu36I酶切位点(利用Bsu36I识别位点中有可变碱基)，两个Bsu36I酶切位点之间插入一个带有强启动子Prrn的GFP作为反选择标记。所有感兴趣的肝脏ORF经过PCR扩增后(引物两端加上TTAC与TGAC接头)，经过T4DNApolymerase处理后直接和经Bsu36I酶切的载体相连。 (2)利用生物信息学分析结果，选取了与代谢、物质转运、氧化应激、信号转导、转录调控和细胞周期调控等相关的肝脏基因430个，用PCR方法扩增这430个基因，PCR产物与pDBlg相连接，并测序验证重组质粒。 (3)430个重组质粒分别转化Mav203后，将430个mav203(pDB-x)进行自激活验证后，利用改进的双杂交系统，筛选人类肝脏cDNA文库，对于筛选到的阳性克隆经质粒拯救、测序、Blast分析后共得到蛋白质相互作用对471对，再次回溯到酵母体内验证，其阳性率约为60﹪。 (4)数据初步分析，结合军事医学科学院和复旦大学等单位的相互作用对数据，初步绘制出肝脏重要蛋白质相互作用连锁草图。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

第一部分：文献综述

第二部分材料与方法

第三部分结果与分析

第四部分：讨论

参考文献

附录

致谢