红松合子胚愈伤组织诱导及不定芽发生的研究

摘要

红松（Pinus koraiensis）是我国东北地区极其重要的优质用材树种，也是发展前景巨大的坚果经济林树种。进行红松体细胞胚胎发生和不定芽发生研究，既可以为其生物学研究提供有效组培体系，又可以直接用于优良种质材料的无性扩繁。但是，目前有关红松组织培养的研究资料很少见。本项研究以红松成熟和未成熟合子胚为试验材料，对红松愈伤组织诱导和增殖的影响因素，及不定芽发生的条件进行了初步研究，以便为体细胞胚胎发生和通过不定芽途径进行植株再生奠定基础。主要结果如下：
　　(1)红松愈伤组织的诱导与合子胚外植体采集时期密切相关。在6月下旬至7月下旬取材时，合子胚处于前子叶期及子叶期，此时愈伤组织不易诱导和保持，有效愈伤诱导率几乎为0;8月中旬至9月下旬取材时，合子胚趋近成熟时期，有效愈伤组织诱导率明显提高，但较容易转为非胚性愈伤组织;10月份取材时，合子胚处于成熟期，此时有效愈伤组织诱导的频率和质量都很高，且能较长时间的保持旺盛分化和鲜活状态。
　　(2)不同的培养基对有效愈伤组织的诱导效果不同，初始诱导应选用盐浓度较高的LM培养基使外植体完全脱分化，反复继代后可以产生有效愈伤组织;供试的其他培养基继代后极少产生有效愈伤组织。
　　(3)不同的激素组合和浓度配比对有效愈伤组织的诱导率影响不同，2，4-D是愈伤组织启动的不可或缺的植物生长调节剂，其作用远远大于NAA。在LM+2 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA的诱导培养基中加入0.5 mg·L-1 KT或0.5 mg·L-1 TDZ，可显著提高有效愈伤组织的诱导率（可达75.7％）。
　　(4)对合子胚外植体进行预处理对愈伤组织的诱导有明显促进效果。经不同浓度的蔗糖、PEG6000、甘露醇溶液浸泡24 h后，愈伤组织2周后产生，愈伤组织多为透明疏松或白色半透明状态，可长时间（60 d左右）保持鲜活状态。3种处理后的合子胚甲均有效愈伤组织诱导率90％以上，但后期继代大多转为非胚性愈伤组织。
　　(5)在有效愈伤组织的增殖培养阶段，需降低生长素和细胞分裂素的浓度。添加KT的增殖效果好于6-BA。较好的增殖继代培养基为LM+0.3 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-1KT。LM+0.01 mg·L-1TDZ也可使有效愈伤增殖率达到较高水平(60％)。
　　(6) ABA、PEG6000和甘露醇在一定浓度时对愈伤组织的增殖有促进作用。不添加激素的LM培养基，加入5 g·L-1 ABA时极显著提高增殖率;加入10～15 g·L-1 PEG6000或0.5 g·L-1甘露醇时显著提高增殖率。3种添加物显著提高增殖率均在30％左右。
　　(7)红松离体胚的萌发适宜培养基为DCR或BM培养基，暗培养情况下10 d左右可见胚根伸长。不定芽诱导的适宜培养基是DCR+0.5 mg·L-16-BA，暗培养较适宜，最佳外植体为完整的成熟合子胚。

目录

论文说明

摘要

1 绪论

1．1 红松

1．2 红松的研究历史

1．3 针叶树组织培养的现状

1．3．1 植物体细胞胚胎发生的研究概况

1．3．2 体细胞胚胎发生过程中的影响因素

1．3．3 器官发生的研究概况

1．4 课题的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料采集

2．1．1 材料灭菌

2．1．2 外植体的制备

2．1．3 培养条件

2．2 试验方法

2．2．1 红松愈伤组织的诱导培养

2．2．2 红松愈伤组织的继代增殖培养

2．2．3 红松成熟离体胚的器官发生

2．2．4 数据分析

3 结果与分析

3．1 灭菌方法对外植体灭菌效果的影响

3．2 红松愈伤组织诱导培养阶段

3．2．1 基本培养基对愈伤组织诱导的影响

3．2．2 不同成熟度合子胚对红松愈伤组织诱导的影响

3．2．3 不同外植体对红松愈伤组织诱导的效果

3．2．4 植物生长调节物质对红松愈伤组织诱导的影响

3．2．5 接种前处理方式对红松愈伤组织诱导的影响

3．3 红松愈伤组织的继代增殖培养阶段

3．3．1 生长调节物质对红松有效愈伤组织质量的影响

3．3．2 不同蔗糖浓度对红松有效愈伤组织增殖的影响

3．3．3 添加其他物质对红松有效愈伤组织增殖的影响

3．4 红松离体胚的萌发和不定芽的诱导培养

3．4．1 红松离体胚的萌发培养

3．4．2 红松离体胚不定芽的诱导

4 讨论

4．1 外植体的灭菌

4．2 胚性愈伤组织的诱导培养阶段

4．2．1 培养基与胚性愈伤组织的诱导

4．2．2 外植体与胚性愈伤组织的诱导

4．2．3 植物生长调节物质与胚性愈伤组织的诱导

4．2．4 接种前处理与胚性愈伤组织的诱导

4．3 胚性愈伤组织的增殖培养阶段

4．3．1 蔗糖浓度与胚性愈伤组织的增殖

4．3．2 ABA、PEG和甘露醇与胚性愈伤组织的增殖

4．4 红松离体胚的荫发和不定芽的诱导

结论

1 主要结论

2 本研究的创新性

3 存在的问题及建议

图版

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明