碱茅Put-R40g3基因在逆境胁迫下的功能解析

摘要

当前，盐碱地面积的不断扩大对农牧业生产和农业经济的繁荣都产生了严重的影响，因此对盐碱地资源的开发和利用有着极其重要的现实意义。
　　本论文以这一现状为研究背景，采用碱茅(Puccinellia tenuiflora)作为试验材料，从碱茅cDNA文库中分离得到Put-R40g3基因(登录号:AB465547)。克隆的cDNA全长为869bp，其编码的蛋白质共有195个氨基酸，与水稻、小麦和拟南芥的R40g3蛋白的氨基酸序列有较高的同源性。对经逆境处理的碱茅幼苗根、叶中该基因的表达分析结果表明，碱茅中Put-R40g3基因的表达有被ABA、盐(NaCl、Na2CO3、 NaHCO3)和干旱诱导的趋势。这个结果预示了Put-R40g3基因与逆境存在密切关系
　　利用与植物有类似代谢途径的单细胞真核生物——酵母作为模型来研究Put-R40g3蛋白在细胞内的位置及其在真核细胞中表达时所呈现出来的抗逆性。Put-R40g3蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合在酵母细胞表达的蛋白质定位研究结果表明了Put-R40g3蛋白存在于细胞质中。同时Put-R40g3基因在酵母中表达，使酵母在盐(NaCl、Na2CO3、NaHCO3)、干旱及氧化逆境条件下提高了对逆境的适应能力。
　　在转基因拟南芥中，对获得的能够稳定表达Put-R40g3基因的转基因株系进行盐和干旱胁迫，结果显示转基因株系在逆境下的生根情况要优于野生型拟南芥。此外，转基因株系生长发育的形态有异于野生型，会在茎部或底部生长出一个或多个柄。这个结果预示Put-R40g3是一个与植物发育相关的蛋白。
　　综上所述，本研究只是对Put-R40g基因的特性进行了初步的解析，对于Put-R40g3蛋白在细胞内的生化功能和其性质以及该蛋白在抗逆机理中所发挥的作用还有待于进一步的研究。

目录

摘要

1 绪论

1．1 研究背景(盐碱地现状)

1．2 抗逆功能基因组学研究进展(功能基因的克隆)

1．2．1 功能克隆法

1．2．2 图位克隆法

1．2．3 表型克隆法

1．2．4 DNA芯片技术

1．2．5 电子克隆法

1．3 特殊抗逆植物的研究

1．3．1 盐胁迫对植物生长发育的影响

1．3．2 盐生植物的研究

1．3．3 碱茅

1．4 R40g3基因的研究现状

2 碱茅Put-R40g3基因在逆境条件下的表达特性分析

2．1 材料和试剂

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要试剂

2．2 逆境下Put-R40g3基因的表达特性

2．2．1 碱茅的逆境处理

2．2．2 RT-PCR检测

2．3 结果与分析

2．3．1 碱茅Put-R40g3基因的序列分析

2．3．2 逆境下，Put-R40g3基因的表达特性分析

2．4 本章小结

3 碱茅Put-R40g3基因在酵母中表达的抗性分析及蛋白在细胞内的定位

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株和表达载体

3．1．2 培养基与缓冲液

3．2 碱茅Put-R40g3基因在酵母中表达后呈现出的抗逆性

3．2．1 探针设计与标记

3．2．2 酵母总RNA的提取

3．2．3 载体pYES2-Put-R40g3的构建及转化

3．2．4 碱茅Put-R40g3基因在酵母中表达及其抗逆性分析

3．3 碱茅Put-R40g3蛋白在酵母细胞内定位

3．3．1 预测位置

3．3．2 融合蛋白表达载体pYES2-Put-R40g3-GFP与pYES2-GFP-Put-R40g3构建及转化

3．4 结果与分析

3．4．1 载体构建

3．4．2 探针标记

3．4．3 碱茅Put-R40g3基因在酵母细胞内的定位

3．4．4 碱茅Put-R40g3基因在酵母中表达所呈现的抗逆性

3．5 本章小结

4 转Put-R40g3基因拟南芥对逆境适应性的初步解析

4．1 材料与试剂

4．1．1 材料

4．1．2 试剂

4．2 方法

4．2．1 植物表达载体pBI121-Put-R40g3的构建及转化

4．2．2 真空浸润法转基因

4．2．3 转基因拟南芥的鉴定

4．2．4 转Put-R40g3基因拟南芥植株的抗逆性分析

4．3 结果与分析

4．3．1 植物表达载体pBI121-Put-R40g3的构建

4．3．2 农杆菌重组质粒的PCR鉴定

4．3．3 卡那霉素抗性筛选转基因拟南芥

4．3．4 转Put-R40g3基因拟南芥植株的PCR检测

4．3．5 转Put-R40g3基因拟南芥植株的Northern杂交检测

4．3．6 Put-R40g3转基因植株的抗逆性分析

4．3．7 Put-R40g3基因在拟南芥中过量表达对发育的影响

4．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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