O1型拟南芥硫氧还蛋白基因在逆境胁迫下的功能解析

摘要

当前，在世界范围内，土壤盐渍化及次生盐渍化现象日趋加重，成为主要的环境问题之一。在盐胁迫下，植物生长缓慢，代谢受抑制，严重时出现盐斑、叶片萎蔫，甚至死亡。近年来，随着生物工程的兴起，利用生物措施改良盐碱地成为改良效果持久、稳定且有利于水土保持和生态平衡的措施。因此，研究植物对于胁迫的应答机制，发现相关抗性基因，培育耐逆品种在农牧业生产中具有重要意义。
　　硫氧还蛋白(Trx)是一种低分子量(12kD)、热稳定、酸性蛋白，有高度保守的活性位点WCG/PPC。它们在多种反应中通过可逆的双硫键和硫醇变化起氧化还原载体的作用，是重要的酶活力调节蛋白。它们的功能对细胞来说却是至关重要的，如缓解胞内氧化胁迫、控制生长、细胞程序死亡、细胞因子和趋化因子的活力。自发现硫氧还蛋白以来的几十年里，人们对它的种类、特点、功能等方面有了越来越多的认识，为更好地利用它奠定了必要的基础。
　　本研究中，通过RT-PCR技术克隆了拟南芥硫氧还蛋白基因AtTrx o1，并对其进行了的研究。
　　我们把AtTrx o1型基因构建到原核表达载体pQE-30中。质粒通过热激法转入表达菌株E.Coli M15。经IPTG诱导后，Ni+凝胶亲和层析获得了His-AtTrx o1融合蛋白，但不能够达到后期研究的纯度。我们做了纯化条件的摸索，并没有很好的解决这个问题，在以后的研究中，还要继续摸索纯化条件，以便进行更加深入的对硫氧还蛋白生理生化方面的研究。
　　为了研究硫氧还蛋白基因表达与环境应答之间的关系，通过Northern杂交分析了在NaCl，NaHCO3，ABA和H2O2四种不同程度胁迫下，拟南芥悬浮细胞中Trx o1基因在转录水平上的表达情况。Northern杂交结果表明:Trx o1基因与环境胁迫都有一定的应答关系，对不同的逆境处理变化趋势不同。
　　最后将AtTrx o1基因构建到双元表达载体pBI121中，经农杆菌介导法将基因转入模型植物拟南芥中。获得了能够稳定遗传并且没有受到共抑制的4个转基因株系。对转基因株系进行抗盐性试验，结果表明转AtTrx o1型基因拟南芥都比野生型有更好的生长势。通过分析转AtTrx o1型基因拟南芥在不同浓度NaCl逆境下的发芽情况，发现野生型拟南芥受到严重抑制，而转基因拟南芥所受影响较小。通过统计根长变化，发现在50mM NaCl逆境下，转AtTrx o1型基因拟南芥根伸长量分别比野生型增长了32.5％;在100mM NaCl逆境下，转AtTrx o1型基因拟南芥根伸长量分别比野生型增长了62.5％;在125mM NaCl下增长了53％;在200mM NaCl下，野生型拟南芥不能正常发芽，而转AtTrxo1型基因拟南芥能正常发芽，但生长受到抑制。为了进一步研究转基因拟南芥对盐逆境的耐受关系，我们做了移栽试验，研究表明在100mM NaCl盐胁迫下，野生型植物生长受到严重影响，叶片显得萎缩，而转AtTrx o1型基因拟南芥受到的抑制很小，能够正常生长。
　　以上研究表明，O1型拟南芥硫氧还蛋白基因在植物抵抗外界非生物逆境中起着重要作用，能够提高植物对盐逆境的耐受能力。

目录

摘要

1 绪论

1．1 硫氧还蛋白的研究概况

1．1．1 硫氧还蛋白的结构与类型

1．1．2 硫氧还蛋白的系统分类

1．1．3 硫氧还蛋白的功能

1．2 本课题的主要研究背景，目的及意义

2 O1型拟南芥硫氧还蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

2．1 材料与方法

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 原核表达载体pQE-30-AtTrx o1构建及转化

2．1．3 His-AtTrx o1融合蛋白的小量诱导表达

2．1．4 His-AtTrx o1融合蛋白的大量表达与纯化

2．2 结果与分析

2．2．1 原核表达载体的构建及鉴定

2．2．2 重组融合蛋白在E．coli M15中的表达

2．2．3 His-AtTrx O1融合蛋白在M15中的大量表达与纯化

2．3 本章小结

3 拟南芥Trx o1基因的克隆及在逆境下的表达特性分析

3．1 材料和试剂

3．1．1 菌株和载体

3．1．2 植物材料

3．1．3 主要试剂

3．2 拟南芥Trx o1基因的克隆与分析

3．2．1 拟南芥Trx o1基因的克隆

3．3 Northern blot检测逆境下拟南芥Trx o1基因的转录表达特性

3．3．1 拟南芥悬浮细胞系的逆境处理

3．3．2 探针设计与标记

3．3．3 Northern blot检测

3．4 结果与分析

3．4．1 拟南芥Trx o1基因的克隆

3．4．2 在逆境下，拟南芥Trx o1基因转录水平的表达特性分析

3．5 本章小结

4 拟南芥Trx o1基因对逆境的适应性

4．1 材料与试剂

4．1．1 材料

4．1．2 试剂

4．2 方法

4．2．1 植物表达载体pBI121-AtTrx o1的构建及转化

4．2．2 真空浸润法转基因

4．2．3 转基因拟南芥的鉴定

4．2．4 转拟南芥Trx o1基因拟南芥植株的抗盐碱性分析

4．3 结果与分析

4．3．1 植物表达载体pB1121-AtTrx o1的构建

4．3．2 卡那霉抗性筛选转基因拟南芥

4．3．3 转拟南芥Trx o1基因的拟南芥植株PCR检测

4．3．4 转拟南芥Trx o1基因的拟南芥植株的抗盐碱性分析

4．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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