农杆菌介导的P5CS基因转化东农303马铃薯的研究

摘要

干旱、盐碱、高温、低温等环境条件是影响植物生长发育的重要因素,这些非生物因素通过渗透胁迫(osmotic stress)影响植物细胞膨压从而导致植物的不良生长。在渗透胁迫下,植物将产生一些渗透调节物质抵抗该胁迫,包括脯氨酸和甜菜碱。脯氨酸主要来源于谷氨酸合成途径,△1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶(△1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase,,P5CS)是脯氨酸合成的关键酶。为了提高我国马铃薯栽培品种对环境胁迫的适应能力,本论文实施了来自拟南芥的P5C$基因转化我国马铃薯栽培品种东农303的研究。
　　 首先通过不同植物生长调节剂组合的试验,优化了东农303马铃薯品种的高效再分化体系;其次采用农杆菌介导法将P5CS基因转化到马铃薯基因组中,并通过PCR、PCR片段BLAST、Southern blot检测,验证了目的基因已转入到马铃薯基因组中。另外,探讨了转基因植株在干旱和盐胁迫条件下的生长势和生理生化变化。
　　 1、分别利用马铃薯脱毒试管苗和薯块为试验材料,通过吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、玉米素(ZT)、潮霉素(Hy)的不同组合优化了遗传转化体系。结果表明,最适再分化培养基为MS+ZT3.5mg/L+IAA.1.0mg/L,再分化条件中最适潮霉素筛选压力为6mg/L;最适生根培养基为1/2 MS培养基,生根潮霉秦筛选压力为10mg/L。
　　 2、对潮霉素抗性株系进行了分子生物学检测。利用特异性引物进行了PSCS基因的特异性PCR扩增,获得了一条701bp的所需目的条带;将所获得的目的条带进行连接、转化、测序、BLAST比对,发现目的条带与拟南芥。P5CS基因同源性为100％;分别用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化抗性株系和未转化株系的总DNA,通过进一步的Southern杂交实验,抗性株系获得一条阳性条带,推测P5CS基因在马铃薯基因组中有一个拷贝,最终获得了一个转基因株系。
　　 3、探讨了转基因株系在1.5％NaCl盐和60％、40％、20％干旱胁迫下的植株的生长势和生理生化变化。结果表明,转基因株系在叶片伸展度、根系的发达程度以及在结薯量上均优于非转基因株系。生理生化方面,转基因植株在盐胁迫时产生脯氨酸的含量比未处理时增加了25倍,是未转基因植株的1.7倍,MDA含量的增加仅为未转基因植株的0.4倍,SOD活性则是未转基因植株的2.6倍;在60％、40％、20％的干旱胁迫程度下,转基因植株脯氨酸含量分别是未转基因植株的1.2倍、1.4倍和2.1倍,转基因植株丙二醛含量的增加均是未转基因植株的0.6倍,转基因植株SOD活性分别为未转基因植株的2.5倍、2.8倍和5.6倍。以上试验结果表明转P5CS基因马铃薯的抗旱和耐盐性均得到了提高。