优质蓝莓转LEA基因及耐寒性分析研究

摘要

随着人们生活质量和生活水平的提高,人们的保健意识逐渐增强,许多外国水果备受人们的青睐,其中蓝莓更是深受欢迎。由于蓝莓鲜果价格昂贵、加工工艺不断完善,以及人们逐渐认识到蓝莓对身体健康有益,世界各地蓝莓的种植面积逐年增加。近年来,我国的蓝莓产业也逐渐受到了重视。在我国北方地区,由于冬季低温干燥,蓝莓产业的发展受到了一定限制。因此,为我国北方地区培育营养价值高、对低温耐受能力强的蓝莓新品种已迫在眉睫。本研究对我国北方地区主要蓝莓栽培品种进行了营养价值分析。同时,分别以蓝莓的茎段和叶片为外植体,建立了高效组培再生体系。通过根癌农杆菌介导法将来源于柽柳cDNA文库中的LEA基因转化至营养价值相对较高的蓝莓品种——北陆基因组中,为蓝莓品种选育开辟新的途径。具体研究结果如下:
　　 1.对供试的7个蓝莓品种分别进行了氨基酸含量、总糖含量、蛋白质含量、维生素含量及矿质元素含量的测定。结果表明,北陆各测试指标表现突出,除Vb2和钙含量位居第二外,其他测试指标均列于首位；
　　 2.以不同蓝莓品种的茎段和叶片为外植体,选择基本培养基类型,同时确定植物生长调节物质的种类和适宜浓度。结果表明,在附加玉米素(Zt)的改良WPM培养基中,各品种分化率均较高,但Zt的适宜浓度在各基因型中有所差异；
　　 3.筛选出头孢噻肟钠为蓝莓遗传转化体系的抑菌抗生素,使用浓度为250 mg·L-1；蓝莓遗传转化的选择类抗生素为卡那霉素,其使用浓度为30 mg·L-1；应用农杆菌介导法对蓝莓进行遗传转化,将抗逆LEA基因转化至北陆基因组中,并确定了最优北陆遗传转化体系为:8-10周龄不定芽的中部叶片于25±1℃条件下暗培养48 h,然后将其浸泡在工程菌液(OD600=0.5)中于28℃侵染60 min。侵染之后于共培养培养基中暗培养4 d,转移到延迟选择培养基上,于25±1℃条件下暗培养48 h后将叶片转移到抗性芽筛选培养基上进行选择培养,此阶段需先暗培养7 d后再转至光下培养,并每隔5—7 d脱菌一次；
　　 4.利用农杆菌介导法对蓝莓进行遗传转化初步获得卡那霉素抗性植株13个,经增大选择压,排除5个假阳性株系。对剩余8个阳性株系分别进行了PCR、Southern杂交和RT-PCR检测。结果表明,LEA基因已经整合到北陆基因组中,但不同转化子拷贝数不同。经一步法RT-PCR检测2个株系为转录水平沉默,其他转化子能够正常转录；
　　 5.对8个转基因株系进行低温胁迫,分别测定了胁迫前后丙二醛(MDA)含量、相对电导率(REL)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性。结果表明,在未发生转录水平沉默的6个转基因株系中,胁迫后的MDA含量和REL均低于对照,SOD活性和POD活性在胁迫后均高于对照,且均存在显著差异。说明转入的LEA基因能够正常表达,并提高了转基因北陆的耐寒能力。