微生物胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽和功能蛋白差异表达的研究

摘要

两栖类动物的皮肤在长期进化过程中形成了以抗微生物活性肽为主要成分的比较完善的机体先天免疫防御系统，用以应对环境中多种微生物的侵袭。然而，近年来两栖类种群数量却呈全球性急剧下降，其主要原因之一是由于环境中病原微生物导致的感染性疾病的暴发。虽然近年来对两栖类皮肤活性肽进行了大量的研究，但两栖类如何通过皮肤固有免疫防御机制和生存策略应对环境致病性微生物所带来的威胁，以及两栖类皮肤的先天免疫应答与环境致病性微生物之间的关系目前尚不清楚。因此，利用分子生物学、质谱、高效液相色谱和差异蛋白质表达等技术方法研究病原微生物对两栖类先天免疫防御体系中皮肤活性肽分泌表达变化和规律，对于揭示两栖类在抵御病原微生物侵袭时机体所采取的固有免疫应答机制和策略提供科学依据，对处于濒危状态的两栖类物种的保护具有重要的理论意义和应用价值。
　　本研究以东北地区两栖类的代表物种东北林蛙（Rana dybowskii）为研究对象，选择不同致病性微生物（E.coli、 S.aureus、RGV和A.hydrophila）作为环境胁迫因子，采用RP-HPLC、2D电泳、ESI-MS/MS、荧光定量PCR和高通量表达谱技术等，研究致病性微生物胁迫后蛙皮肤及分泌物中抗菌肽和功能蛋白表达的变化，获得新发现的蛙皮肤抗菌肽基因cDNA序列，并测定了皮肤中抗菌肽和Toll样受体(TLRs)的cDNA不同时间点的表达量变化，及转录组水平的基因表达谱的变化。
　　本研究获得的主要结果如下：
　　1.特定细菌胁迫下东北林蛙皮肤功能蛋白的差异表达
　　2 D电泳和Nano-UPLC-ESI-MS/MS质谱结果显示E.coli、Saureus胁迫后在分泌物中共鉴定出7种有差异的功能蛋白，分别为:超氧化物歧化酶A(Superoxide DismutaseA，SOD A)、激素原转化酶1(prohormone convertase1，PC1)、磷蛋白-1A(Phosphoprotein1A)、碳酰还原酶1(carbonyl reductase1，CBR1)、膜联蛋白A1(annexin A1，ANX-A1)、cofilin-1B(CFL-1B)和组蛋白4(histones，H4)。揭示上述功能蛋白可能参与东北林蛙的自身免疫过程或在免疫过程中起到调节作用。
　　2.蛙类易感细菌胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽的差异表达
　　E.coli、 S.aureus、RGV胁迫下，RP-HPLC、ESI-MS/MS和N端测序结果显示，从东北林蛙皮肤分泌物中获得8个家族的14种多肽序列，四条为全长序列，其它为可信度较高的非全长肽段;其中抗菌肽13条，分属Brevinina-1家族、Brevinina-2家族、Ranatuerin-2家族、Japonicin-1家族、Dybowskin-1家族、Palustrin-2家族、Temperin-1家族和Bradykinin家族。表明东北林蛙皮肤抗菌肽的分泌表达呈多样性，其E.coliS.aureus、RGV胁迫下的抗菌肽谱显示抗菌肽能够为机体提供针对微生物侵袭的动态防御。
　　3.蛙类易感病毒胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽及其TLRs的差异表达
　　虹彩病毒RGV胁迫后RT-PCR技术获得了5条新的东北林蛙皮肤抗菌肽cDNA序列: Dybowskin-YJa、Dybowskin-YJb、Temperin-YJa、Temperin-YJb、Ranatuerin-2YJ。定量PCR检测抗菌肽Ranatuerin-2 YJ(JN126048)和Temporin-1(EU624139)以及TLRs基因在RGV胁迫后的动态表达，结果发现在先天免疫阶段TLR和抗菌肽基因均呈上调表达，且TLR上调时间先于抗菌肽，其中有6类TLR参与了抗RGV感染的免疫应答，提示TLR作为启动先天免疫应答的模式识别受体可能参与抗菌肽的表达调控过程。TLR1和TLR8在1h内迅速出现表达高峰，表明TLR1和TLR8可能参与机体特异识别RGV的过程，在连接固有免疫和获得免疫的关键环节可能发挥重要作用。RGV胁迫下其皮肤分泌物具有较强RGV和S.aureus活性，溶血活性低。
　　4.蛙类易感细菌胁迫下东北林蛙皮肤转录组免疫相关基因的差异表达
　　嗜水气单胞菌A.hydrophila胁迫6h后，高通量表达谱测序技术从蛙皮肤中共获得了1435条表达量变化显著的基因，其中免疫相关基因有106条，包括:brevinin-1、TLR5、C-type lectin、roe lectin、lysozyme、alpha-macroglobulin、Ig、MHCⅠ和MHCⅡ等免疫相关基因，作为先天免疫和获得性免疫的重要组成。结果显示A.hydrophila胁迫后，机体可能通过上述免疫相关基因的协同作用发挥皮肤免疫防御机制，抵御环境致病性微生物侵袭。此外，尚未被注释的差异基因可能在机体免疫应答中发挥调控作用。
　　研究结果表明，不同微生物胁迫后，东北林蛙皮肤抗菌肽和免疫相关基因得以表达，皮肤分泌多种抗菌肽、产生免疫功能蛋白，协同作用抵御环境致病性微生物。该研究结果为进一步理解两栖类动物免疫系统的组成和机制提供了思路。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 两栖类抗菌肽的研究进展

1．2．1 两栖类抗菌肽的分类及体内分布

1．2．2 两栖类抗菌肽的结构特征

1．2．3 两栖类抗菌肽的理化特性

1．2．4 微生物诱导下的抗菌肽的变化

1．3 两栖类Toll样受体的研究进展

1．3．1 TLRs的免疫学功能

1．3．2 TLRs信号传递途径

1．3．3 TLRs在宿主免疫防御中的地位

1．4 两栖类皮肤功能蛋白的研究

1．5 病原微生物与宿主相互作用的研究进展

1．6 本研究的目的和意义

1．7 本项研究采取的技术路线

2 特定细菌胁迫下东北林蛙皮肤功能蛋白的差异表达

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 东北林蛙和模式菌株

2．2．2 构建东北林蛙细菌感染模型

2．2．3 东北林蛙皮肤分泌物的收集

2．2．4 二维凝胶电泳分析

2．2．5 图像分析

2．2．6 质谱分析

2．3 结果

2．3．1 2-DE分析差异表达的蛋白

2．3．2 NanoUPLC-ESI-MS／MS鉴定差异表达的蛋白

2．4 小结

3 蛙类易感细菌胁迫东北林蛙皮肤抗菌肽的差异表达

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 实验动物及微生物

3．2．2 主要仪器

3．2．3 主要试剂

3．2．4 试剂配制

3．3 方法

3．3．1 实验分组

3．3．2 实验动物的处理——虹彩病毒刺激东北林蛙

3．3．3 东北林蛙皮肤分泌物的收集及蛋白浓度测定

3．3．4 RP-HPLC上样前皮肤分泌物的预处理

3．3．5 C18柱分离分泌物并收集洗脱峰

3．3．6 洗脱峰的抑菌活性检测

3．3．7 具有抑菌活性的洗脱峰的二次分离

3．3．8 抗菌肽的序列测定

3．4 结果

3．4．1 正常状态东北林蛙皮肤分泌物RP-HPLC图谱

3．4．2 微生物胁迫后6～72h东北林蛙皮肤分泌物的差异分析

3．4．3 东北林蛙皮肤分泌物洗脱峰的抑菌活性检测及N端测序

3．4．4 东北林蛙皮肤分泌物多肽组分的质谱分析

3．4．5 测序所得四条多肽的理化性质和结构预测

3．5 小结

4 蛙类易感病毒(虹彩病毒)胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽及其TLRs的差异表达

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 试验动物及毒株

4．2．2 主要仪器

4．2．3 主要试剂

4．2．4 试剂的配制

4．3 方法

4．3．1 引物设计

4．3．2 毒液制备

4．3．3 虹彩病毒接种

4．3．4 皮肤分泌物与皮肤组织采集

4．3．5 皮肤分泌物粗提物的制备

4．3．6 RGV感染检测

4．3．7 组织总RNA提取、纯化及完整性检测

4．3．8 反转录及荧光定量PCR

4．3．9 定量PCR的数据处理

4．3．10 RGV感染检测

4．3．11 东北林蛙活性肽的基因克隆

4．3．12 东北林蛙特定活性肽基因的表达变化

4．3．13 胁迫前后皮肤分泌物蛋白多肽浓度测定

4．3．14 皮肤分泌物及合成肽抗微生物活性试验

4．3．15 皮肤分泌物的溶血活性试验

4．3．16 抗虹彩病毒活性试验

4．4 虹彩病毒感染

4．4．1 解剖观察结果

4．4．2 病毒DNA检测

4．5 总RNA质量

4．6 TLRs mRNA的动态表达

4．7 东北林蛙活性肽基因克隆结果

4．7．1 RT-PCR扩增结果

4．7．2 重组质粒的PCR检测结果

4．7．3 活性肽cDNA序列及其编码的活性肽

4．8 Real-time PCR检测目的基因的表达变化

4．9 皮肤分泌物及合成肽抗微生物活性测定

4．9．1 细胞毒性测定

4．9．2 抗病毒活性测定

4．9．3 抑菌活性测定

4．10 皮肤分泌物溶血活性测定

4．11 小结

5 蛙类易感细菌(嗜水气单胞菌)胁迫下东北林蛙皮肤转录组免疫相关基因的差异表达

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 实验动物

5．2．2 主要试剂

5．2．3 主要仪器

5．3 实验方法

5．3．1 菌液的制备

5．3．2 实验动物预处理与样品采集

5．3．3 总RNA提取与质量检测

5．3．4 表达谱文库构建、测序及功能注释

5．3．5 测序评估

5．3．6 表达差异基因的筛选与功能分析

5．4 结果与分析

5．4．1 测序评估

5．4．2 差异表达基因筛选

5．4．3 差异表达基因的聚类分析

5．4．4 差异表达基因在细胞信号通路上的变化

5．4．5 差异表达的免疫相关基因的研究

5．5 小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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