特定细菌胁迫下东北林蛙(Rana dybowskii)皮肤抗菌肽分泌的动态变化

摘要

两栖类作为由水生过渡到陆生的物种,其生境中微生物区系十分复杂,在长期进化过程中两栖类皮肤逐步建立了通过皮肤分泌抗菌肽等物质以有效抵御环境中病原微生物侵袭的天然免疫防御体系。但近年来发现两栖类种群数量呈全球性急剧减少或消失趋势,认为导致这一现象的重要原因之一是两栖类感染性疾病。然而目前对于两栖类皮肤抗菌肽与环境微生物之间的关系尚不清楚。
　　 本研究以东北地区两栖类代表物种东北林蛙(Rana dybowskii)为试验对象,实验分6～72h、1～23d两个观察时段。6～72h时段,设4组:E.coli菌浴组、E.coli淋巴囊注射组、S.aureus菌浴组、S.aureus淋巴囊注射组。1～23d时段,采用温和电刺激法排空腺体内的分泌物后,设E.coli菌浴组和LB培养基组。通过对不同细菌胁迫下的不同时段东北林蛙皮肤分泌物的蛋白多肽浓度测定、RP-HPLC多肽图谱分析、抑菌活性和溶血活性分析等,观察其皮肤分泌物的特征和抗菌活性变化,以期揭示两栖类动物抵御环境微生物时皮肤分泌抗菌肽的动态变化规律。
　　 结果显示,胁迫前东北林蛙皮肤分泌物(正常对照组)RP-HPLC分离获得26个洗脱峰,显示出较强的广谱抗菌活性,尤以对G+细菌活性抑制更显著,低溶血活性。
　　 胁迫6～72h后,RP-HPLC多肽图谱显示,洗脱峰数量无明显变化,但峰C～K呈特异性变化,除峰C、D和E呈现波动变化外,峰F、G和H在胁迫后峰面积值均明显上升,峰I和K在胁迫后峰面积值均明显下降。东北林蛙皮肤分泌物蛋白浓度和抑菌活性均呈时间依赖性增强趋势。
　　 胁迫1～23d后,RP-HPLC多肽图谱显示,1～18d皮肤分泌物洗脱峰数量明显减少至4～10个,至23d基本恢复至胁迫前水平,其中A、B、C和D这4个洗脱峰持续出现,并具有较强的抑制G-和G+菌活性。蛋白多肽浓度第1天显著下降,1～7dE.coli菌浴组显著高于LB组,而13～18d则相反。东北林蛙分泌物排空后至少需要23天才可恢复到胁迫前水平,在此期间分泌物仍具有抗菌活性。
　　 本研究结果表明,东北林蛙蛙皮肤分泌物中抗菌肽作为皮肤免疫防御体系的重要组成,对环境中不同微生物胁迫刺激可提高其抗菌肽抗菌活性,并表现出非特异性应答反应,但对致病性较强的S.aureus更为敏感。该研究结果为进一步揭示东北林蛙皮肤分泌物的作用方式及变化规律提供了重要的理论和实验依据。