干旱胁迫下欧李幼苗的生理响应与差异蛋白表达分析

摘要

在干旱胁迫下，植物细胞通过干旱信号的感知和传导来调节基因表达，蛋白质变化，从而引起形态、生理、光合作用、呼吸作用、抗氧化系统等各项指标的变化。本研究以北京怀柔县引进的欧李(Cerasus humilis)种为实验材料，研究了2年生欧李幼苗正常供水（对照）、轻度干旱、中度干旱胁迫3种供水处理条件下，光合、呼吸和抗氧化系统等生理指标，同时对重度干旱胁迫下欧李总蛋白的表达进行分析，并通过RT-PCR对14个参与光合作用和呼吸作用等的基因表达进行验证。主要的研究结果如下:
　　1在干旱胁迫下，欧李叶片中主要以过氧化物酶(POD)活性的增强来提高植物对干旱环境的适应能力，而超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性均降低。欧李叶片总呼吸速率加强，交替呼吸和细胞色素呼吸两条电子传递途径也发生改变。交替呼吸随时间的延长，速率升高，而细胞色素呼吸则呈现下降趋势，这可能与植物细胞中水分的缺失有关。而可溶性糖含量的积累，有助于植物进行渗透调节，缓解由于干旱给植物带来的伤害。
　　2成功构建出具有高稳定性和高重复性的欧李蛋白质双向电泳体系，得到高清晰度，高分辨率，高重复性的双向电泳图谱。具体针对能影响欧李蛋白质双向电泳效果的最适胶条pH范围、胶条承载量、等电聚焦时间以及SDS-PAGE电泳的运行条件等因素，进行优化对比实验，确定了各因素的最优条件。我们比较了pH3-10与pH4-7范围的胶条，发现在pH4-7上的胶条上的蛋白质点最为清晰、可靠。
　　3通过软件分析比对，干旱胁迫下的欧李蛋白质出现显著差异的点共有76个(变化量超过2倍，P≤0.05)。这76个蛋白质点中出现上调表达的有14个，出现下调表达的有62个。通过MALDI-TOFMS和Q-TOFMS方法，我们将这76个差异蛋白质点进行分析鉴定。
　　4根据蛋白质功能分类，我们将48个蛋白质归为11个功能组。主要包括:光合作用，碳和能量代谢，蛋白质水解，蛋白质合成，蛋白质折叠和转运，转录相关，胁迫和防御，膜和转运，细胞凋亡和其他代谢相关蛋白。另外，除了已经发表过的已知功能蛋白，我们还发现了2个未知功能的蛋白。这些蛋白给干旱胁迫的分子响应机制的深入研究奠定了基础和提供新的思路。
　　5本实验通过对已经鉴定出来的69个蛋白质中进行挑选出14个蛋白质，分别参与能量代谢、糖代谢、胁迫防御相关。在mRNA水平通过RT-PCR对这14个基因进行表达分析，研究结果表明基因水平上的表达变化趋势与蛋白质水平的表达变化趋势具有较高的相似性，表明质谱鉴定结果具有较高的可靠性。

目录

摘要

1 绪论

1．1 欧李简介

1．2 植物干旱胁迫的研究现状

1．3 干旱胁迫对植物生理方面的影响

1．3．1 干旱胁迫对植物形态的影响

1．3．2 干旱胁迫对植物光合作用的影响

1．3．3 干旱胁迫对植物呼吸作用的影响

1．3．4 干旱胁迫对植物叶绿素含量的影响

1．3．5 干旱胁迫对可溶性糖含量的影响

1．3．6 干旱胁迫对植物抗氧化胁迫系统的影响

1．4 蛋白质组学研究概况

1．5 本文的研究目的及意义

2 干旱胁迫下欧李叶片的生理响应

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 可溶性糖含量测定

2．2．2 呼吸速率的测定

2．2．3 欧李叶片气体交换参数的测定

2．2．4 叶绿素含量的测定

2．2．5 抗氧化胁迫系统相关酶的测定

2．3 结果与分析

2．3．1 干旱胁迫下欧李可溶性糖含量的变化

2．3．2 干旱胁迫下欧李呼吸速率的变化

2．3．3 欧李叶片气体交换参数的变化

2．3．4 叶绿素含量的变化

2．3．5 抗氧化酶的变化

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 差异蛋白质组学在欧李干旱胁迫下的应用

3．1 实验材料

3．2 研究方法

3．2．1 蛋白质样品的制备

3．2．2 欧李叶片气体交换参数的变化欧李干旱处理与取样

3．2．3 欧李蛋白质的提取

3．2．4 欧李蛋白质溶解

3．2．5 欧李蛋白质浓度测定

3．2．6 双向凝胶电泳分析

3．3 数据分析

3．4 结果与分析

3．4．1 双向凝胶电泳分析 欧李总蛋白的提取和溶解

3．4．2 欧李2-DE电泳分析

3．4．3 干旱处理下差异蛋白质的鉴定

3．4．4 质谱结果

3．5 讨论

3．5．1 参与光合作用相关蛋白

3．5．2 参与胁迫相关蛋白

3．5．3 参与糖类代谢相关蛋白

3．5．4 参与蛋白质合成、转运和水解的相关蛋白

3．6 本章小结

4 与干旱胁迫相关基因的表达

4．1 实验材料

4．2 研究方法

4．2．1 CTAB法提取总RNA

4．2．2 RNA的消化和纯化

4．2．3 RNA的反转录

4．2．4 引物的设计及合成

4．2．5 RT-PCR分析

4．3 数据统计

4．4 结果与分析

4．5 讨论

4．6 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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