干旱胁迫下凹叶厚朴的生理响应及差异蛋白表达分析

摘要

凹叶厚朴（Magnolia officinalis subsp.biloba）是集药用、材用和观赏等功能为一体的珍贵树种。水分是凹叶厚朴资源保护和人工栽培重要的限制性生态因子之一。研究凹叶厚朴对干旱胁迫的生理指标变化及响应机制，对提高凹叶厚朴抗旱性和指导抗旱品种选育具有重要意义。本文通过盆栽试验，研究了持续干旱胁迫下（以6d为一个间隔期，持续干旱30 d），3年生的凹叶厚朴幼苗的形态指标、土壤含水量（SWC）、叶片含水量（LWC）、叶片水势（LWP）、光合特性等生理指标变化，运用2-DE技术与MALDI-TOF-MS手段相结合，对干旱胁迫下凹叶厚朴叶片差异表达蛋白进行分析。
　　本研究主要内容包括：⑴凹叶厚朴幼苗随着干旱程度的加深，叶片的萎蔫和叶卷程度逐渐增加。SWC为11.88％时出现发黄、斑点等伤害症状，SWC为7.37%时叶片边缘卷曲、失水下垂，SWC为3.93%地上部分失水死亡。在干旱胁迫6~30 d，SWC、LWC显著降低，30 d时SWC仅为对照组的13.86%；12 d后LWP急剧下降，30 d后LWP下降至-4.65 Mpa。凹叶厚朴叶绿素相对含量SPAD随着SWC降低呈下降的趋势。干旱胁迫下凹叶厚朴水分生理状态变差，叶绿素含量显著降低。⑵干旱胁迫下凹叶厚朴幼苗叶片 Pn、Tr、Gs显著降低，Ci呈先下降后上升的趋势；瞬时水分利用效率（PWUE）呈先升高后降低的趋势；气孔因素和非气孔因素共同作用影响凹叶厚朴幼苗的光合作用，在干旱时间（0~18 d）气孔因素起主导作用，在干旱时间（＞18 d），非气孔因素起主导作用。初始荧光(Fo)呈先升高后下降的趋势，而最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、表观光合电子传递速率（ETR）随着干旱胁迫程度的加剧逐渐降低；24 d后凹叶厚朴光合机构被破坏，Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR分别由0.79、0.65、21.84下降到0.42、0.41、3.93。光合特性指标与 SWC、LWP极显著相关（P＜0.01），气孔是影响气体交换参数变化的主导因素。⑶干旱胁迫下脯氨酸（Pro）含量变化随SWC下降呈先上升后下降的趋势，在第18 d时达到峰值（29.96μg·ml-1），与对照组相比增加了250.1%，具有一定保水能力；干旱胁迫下0~18d LWC下降幅度较小，这与凹叶厚朴体内积累Pro进行渗透调节有关。在干旱胁迫0~30 d，MDA含量显著增加，24 d时最高（32.34 nmol·ml-1），与对照组相比增加了121.4%。⑷建立一套适合于凹叶厚朴叶片全蛋白2-DE体系，比较3种蛋白的提取方法，筛选最佳胶条承载量、等电聚焦条件。采用 TCA/丙酮+Tris-酚法提取凹叶厚朴叶片蛋白效果最好，选用17 cm pH5-8 NL的IPG胶条，样品上样量为17μg，SDS-PAGE浓度为10%，按IEF程序Ⅱ进行2-DE分离和银染，得到分辨率清晰、稳定性高的2-DE图谱。⑸在该2-DE优化体系基础上，研究了对照组和干旱胁迫12 d后2-DE图谱差异，共有45个显著差异的蛋白点（Ratio≥2，p≤0.05）。其中丰度上调有10个，丰度下调有18个，新增蛋白点10个，消失蛋白点7个。通过MALDI-TOF-MS分析和NCBI、Uniport等数据库搜索匹配，确定32个差异蛋白信息。⑹对成功鉴定的32个蛋白进行了COG功能分类、GO注释分析及参与 KEGG通路的分析。在凹叶厚朴幼叶中鉴定的差异蛋白，分别涉及到细胞结构（3.13%），氨基酸转运与代谢（3.13%），光合作用（9.38%），翻译后修饰、蛋白转化、分子伴侣（12.50%），能量生产和转换（15.63%），碳水化合物运输和代谢（21.88%），未知功能蛋白分类（34.38%）。其中有20个酶类参与了18个代谢通路，其中光合碳固定途径有8个酶类参与，碳代谢有8个酶类参与，光合作用途径7个酶类参与，乙醛酸盐和二羧酸代谢有4个酶类参与，糖酵解和糖异生及氨基酸合成途径各3个酶类参与。凹叶厚朴叶片在响应干旱胁迫过程中，相关蛋白表达量变化起到了重要作用，为研究凹叶厚朴响应干旱机制提供参考。

目录

声明

1 前言

1.1 凹叶厚朴简介

1.2 干旱胁迫下植物生理方面的研究进展

1.2.1 干旱胁迫对植物形态结构的影响

1.2.2 干旱胁迫对水分生理指标的影响

1.2.3 干旱胁迫对气体交换参数的影响

1.2.4 干旱胁迫对叶绿素荧光参数的影响

1.2.5 干旱胁迫对植物叶绿素的影响

1.2.6 干旱胁迫对植物膜系统稳定性的影响

1.2.7 干旱胁迫对脯氨酸含量的影响

1.3 蛋白组学的研究进展

1.3.1 蛋白组学概念及研究内容

1.3.2 蛋白组学在植物干旱胁迫中的应用

1.4 研究内容

2 材料与方法

2.1 植物材料

2.2 试验设计

2.3 试验方法

2.3.1胁迫生理的测定

2.4.2 叶片气体交换参数的测定

2.4.3 叶片叶绿素荧光参数的测定

2.4.4 叶绿素含量、Pro和MDA含量的测定

2.4 凹叶厚朴蛋白质双向电泳体系的构建

2.4.1 样品的制备

2.4.2 主要试剂配方

2.4.2 蛋白质裂解与定量

2.4.3 双向电泳

2.4.4 电泳凝胶染色

2.4.5 凝胶扫描与图谱分析

2.5 干旱胁迫下凹叶厚朴差异蛋白表达分析

2.5.1 干旱程度材料的选择

2.5.2 凹叶厚朴全蛋白的提取

2.5.3 电泳凝胶染色

2.5.4 凝胶扫描与图谱分析

3 结果与分析

3.1 凹叶厚朴幼苗叶片生理指标的变化

3.1.1 干旱胁迫对水分生理指标的影响

3.1.2 干旱胁迫对叶片气体交换参数的影响

3.1.3 干旱胁迫对叶片叶绿素荧光参数的影响

3.1.4 干旱胁迫对叶绿素含量、Pro和MDA含量的影响

3.1.5 干旱胁迫下光合生理指标的相关性分析

3.2 凹叶厚朴蛋白质双向电泳体系的构建

3.2.1不同提取方法的2-DE图谱比较

3.2.2 不同聚焦程序对2-DE图谱的影响

3.2.3不同上样量对2-DE图谱的影响

3.3 干旱胁迫下凹叶厚朴差异蛋白表达分析

3.3.1 干旱胁迫下凹叶厚朴2-DE图谱比较

3.3.2 差异蛋白的质谱鉴定结果

3.3.3 干旱胁迫下凹叶厚朴差异蛋白点的质谱图

3.3.4 鉴定差异蛋白COG功能分类

3.3.5 鉴定差异蛋白GO注释和分析

3.3.6鉴定差异蛋白参与的KEGG通路分析

4 结论与讨论

4.1 结论

4.1.1 干旱胁迫下凹叶厚朴幼苗叶片生理指标的变化

4.1.2 凹叶厚朴叶片全蛋白2-DE体系的构建

4.1.3 干旱胁迫下凹叶厚朴2-DE图谱分析

4.1.4 差异蛋白鉴定及功能分析

4.2 讨论

4.2.1 干旱胁迫下凹叶厚朴叶片的生理响应解析

4.2.2 凹叶厚朴叶片全蛋白2-DE体系

4.2.3 与光合作用相关蛋白

4.2.4 与碳水化合物代谢相关蛋白

4.2.5 与能量代谢相关蛋白

4.2.6 与细胞骨架相关蛋白

4.2.7 胁迫相关蛋白

4.2.8 其他相关蛋白

参考文献

缩略词（Abbreviation）

附录A

附录B

附录C

致谢