不同底物诱导下白囊耙齿菌的酶学性质及胞内蛋白质组学分析

摘要

本文以木材白腐真菌-白囊靶齿菌为研究材料，探讨其在PDA固体平板培养基中生长趋势，发现它与大多数真菌生长特点一样，即起始较为缓慢，之后生长迅速呈指数上升，最后转为平缓增长。在不同的培养温度下(23℃、28℃)，其生长速度差异较大，在28℃条件下的生长速度高于23℃条件，说明白囊靶齿菌更适合在28℃下生长。
　　采用白桦和云杉木屑为诱导物，非木屑处理为对照，检测了白囊靶齿菌分泌的木质纤维素酶活性，研究显示该菌分泌的木质素降解酶中漆酶活性最强，木质素过氧化物酶次之，锰过氧化物酶活性最低。木屑诱导下的白囊靶齿菌产生的木质素降解相关酶酶活性大都高于对照样品，且锰过氧化物酶和漆酶活性在处理组与对照组间差异达显著和极显著水平。纤维素酶酶活中葡萄糖外切酶活性远大于葡萄糖内切酶活性，而外切酶活性随培养时间增加而上升，内切酶活性是先上升后下降，两种酶活总体上趋于稳定，表达量较高，受培养时间的影响变化不明显。
　　利用2-DE双向电泳和考染串联-质谱技术分析了白囊耙齿菌在不同树种木屑诱导下的菌体胞内蛋白质组变化，未加木屑的对照组检测到823个蛋白质点，白桦处理组检测到673个蛋白质点，云杉处理组检测到684个蛋白质点。与对照组相比，在白桦和云杉木屑处理组中检测发现32个明显差异蛋白点，有22个蛋白点是上调表达，10个蛋白点下调表达。白桦和云杉处理组各有3个特异差异蛋白点，白桦木材诱导下特异表达蛋白与膜蛋白、膜运输和能量提供有关，而云杉诱导组特异表达蛋白均与蛋白合成有关。在全部的差异蛋白点中有三个蛋白点与哺乳动物的蛋白质有很高的同源性。而675、506、508、228、和211五个差异蛋白点的质谱结果显示为假设蛋白，其功能目前还不明确，可能是新发现蛋白质。其余的22个差异蛋白点的功能包括有机物质代谢蛋白、ATP合成蛋白、物质运输蛋白、呼吸作用蛋白、转录/翻译蛋白、能量代谢蛋白、氧化还原蛋白、调节蛋白等。在胞内蛋白质组检测中几乎没有发现木质纤维素降解酶差异表达，也进一步证实该菌木质纤维素酶类为胞外分泌酶。

目录

摘要

1 绪论

1．1 木材的主要构成

1．2 木材的腐朽机理和类别

1．2．1 腐朽机理

1．2．2 木材的腐朽类别

1．3 木材腐朽菌类型

1．3．1 木材白腐菌

1．3．2 木材褐腐菌

1．3．3 木材软腐菌

1．4 白囊耙齿菌的生物学特性与研究现状

1．5 木质纤维素降解酶

1．5．1 木质素降解酶

1．5．2 纤维素降解酶

1．5．3 木质纤维素酶研究进展

1．6 差异蛋白质组学

1．6．1 蛋白质组学简述

1．6．2 差异蛋白质组学方法与应用

1．7 研究目的和意义

2 白囊耙齿菌的木质纤维素酶学特性

2．1 实验材料与设备

2．1．1 实验材料

2．1．2 设备与仪器

2．2 培养基与试剂配制

2．2．1 PDA固体培养基的配制

2．2．2 葡萄糖-马铃薯液体培养基

2．2．3 产酶固体培养基的配制

2．2．4 葡萄糖标准溶液的制备

2．2．5 DNS(3，5二硝基水杨酸)的制备

2．3 实验方法

2．3．1 菌种活化与纯化

2．3．2 菌在PDA培养基生长速度的测定

2．3．3 木质素降解相关酶活性检测

2．3．4 纤维素降解相关酶活性检测

2．4 结果与分析

2．4．1 白囊耙齿菌在PDA固体培养基中生长速度

2．4．2 木质素降解相关酶活性变化

2．4．3 纤维素降解相关酶活性变化

2．5 本章小结

3 不同木屑诱导下白囊耙齿菌胞内蛋白质组差异表达

3．1 试验材料

3．2 仪器设备与试剂

3．2．1 仪器设备

3．2．2 主要试剂及配制方法

3．3 实验方法

3．3．1 白囊耙齿菌的培养

3．3．2 菌体总蛋白的提取

3．3．3 标准曲线的制备与蛋白质定量

3．3．4 第一向等电聚焦(IEF)

3．3．5 胶条的平衡与第二向SDS-PAGE 电泳(SDS-PAGE electrophresis)

3．3．6 凝胶的着色及扫描对比检测(Detection／Staining)

3．3．7 差异蛋白的质谱鉴定及功能分析

3．4 结果与分析

3．4．1 菌体蛋白丙烯酰胺电泳

3．4．2 蛋白样品图谱

3．4．3 不同木屑诱导下的蛋白表达差异

3．4．4 蛋白质谱同源性分析

3．4．5 鉴定的蛋白质不同功能类群分布

3．5 本章小结

4 讨论与结论

4．1 讨论

4．2 结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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