水貂肺炎病原菌的检测及绿脓杆菌多价灭活疫苗的制备与免疫研究

摘要

水貂细菌性肺炎是困扰水貂养殖业的难题，为了调查引起该病的主要病原菌并探索安全有效的防治方法，2011年至2013年，对从山东、辽宁两省送检的水貂肺炎病例进行病原菌分离，共分离到38株细菌，结合生化鉴定和分子生物学鉴定方法，最终确定包括31株绿脓杆菌，4株肺炎克雷伯氏菌，1株臭鼻克雷伯氏菌，1株产酸克雷伯氏菌和1株与绿脓杆菌混合感染的鲍曼不动杆菌。绿脓杆菌包括三个血清型G型(22/31)、C型(6/31)、B型(3/31)，G型为主要流行血清型。药敏试验结果显示所分离到的38株肺炎病原菌均对亚胺培南和美洛培南敏感，对氨苄青霉素和阿莫西林/克拉维酸耐药。所有分离到的病原菌均对小鼠有较强致病性。
　　取绿脓杆菌G、C、B血清型各一株，做标准抗原，并免疫家兔，采集血清做标准抗体，通过方阵凝集试验确定标准抗原抗体最适反应浓度。将分离到的绿脓杆菌菌株免疫小鼠，采集血清，利用标准抗原检测免疫后小鼠血清效价，最终筛选了PA-L14(G型)、PA-L05（B型）、PA-L06（C型）三株免疫原性较好的菌株作为疫苗候选菌株。以终浓度为0.3％甲醛，经37℃、24h对菌液进行灭活处理。疫苗包含9×109CFU/mL的G型和B型绿脓杆菌，6×109CFU/mL的C型绿脓杆菌，配以20％铝胶佐剂，0.01％的硫柳汞，免疫健康无抗体的水貂进行抗体效价跟踪，结果显示免疫水貂在半月内机体可产生较高水平的抗体，该抗体水平可维持3个月，满足了在绿脓杆菌出血性肺炎流行季节对水貂的保护要求，大规模动物免疫回访结果显示，疫苗速发接种反应发生率低，预后良好，对预防接种和发病后紧急接种，均具有较好的保护性。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 相关领域研究概况

1．2．1 水貂在我国的养殖情况

1．2．2 水貂肺炎

1．2．3 绿脓杆菌基本特性

1．2．4 绿脓杆菌分型方法

1．2．5 绿脓杆菌致病性与防治方法

1．2．6 克雷伯氏杆菌概述

1．2．7 鲍曼不动杆菌概述

1．2．8 常见细菌鉴定方法

1．3 主要研究内容及意义

2 水貂肺炎病原菌的分离鉴定及药敏分析

2．1 材料

2．1．1 样本来源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 试剂配制

2．1．4 主要仪器

2．1．5 引物序列

2．1．6 实验动物

2．2 方法

2．2．1 病原菌的分离培养

2．2．2 绿脓杆菌鉴定及血清型分析

2．2．3 其他肺炎病原菌的生化鉴定

2．2．4 其他病原菌的分子生物学鉴定

2．2．5 分离菌株药敏试验

2．2．6 分离菌株致病性试验

2．3 结果

2．3．1 绿脓杆菌的分离及血清型

2．3．2 其他肺炎菌的分离及鉴定

2．3．3 38株分离菌株药敏试验

2．3．4 分离株致病性试验

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 绿脓杆菌多价灭活疫苗的制备与免疫研究

3．1 材料

3．1．1 试验动物

3．1．2 主要试剂及仪器

3．2 方法

3．2．1 绿脓杆菌生长曲线的测定

3．2．2 细菌含量(CFU／mL)与OD600关系

3．2．3 标准抗原抗体的制备

3．2．4 免疫原性良好菌株的筛选

3．2．5 甲醛灭活的浓度、温度、时间

3．2．6 疫苗的配制及保存

3．2．7 免疫剂量的确定

3．2．8 水貂免疫效价跟踪

3．2．9 大规模动物免疫效果检测

3．3 结果

3．3．1 绿脓杆菌生长曲线

3．3．2 细菌含量(CFU／mL)与OD600关系

3．3．3 标准抗原抗体的制备

3．3．4 免疫原性良好菌株的筛选

3．3．5 甲醛灭活的浓度、温度、时间

3．3．6 疫苗的配制及保存

3．3．7 水貂免疫剂量的确定

3．3．8 水貂免疫效价跟踪

3．3．9 大规模动物免疫保护效果检测

3．4 讨论

3．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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