鸦胆子油乳及其联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞体内外生长抑制作用的研究

摘要

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，严重威胁着女性健康及生命。中药鸦胆子油乳注射液具有细胞周期非特异性抗肿瘤作用，同时可以改善细胞免疫状态，毒副作用小，是临床上广泛应用的抗肿瘤中药。本课题选用鸦胆子油乳注射液为研究对象，采用四氮唑盐(MTT)法检测不同浓度鸦胆子油乳以及临床常用抗肿瘤药物顺铂与鸦胆子油乳联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用;通过透射电镜对凋亡细胞进行形态学观察;流式细胞仪检测细胞凋亡率;RT-PCR、Western blot法对鸦胆子油乳、顺铂及其两者联合诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡过程中NF-κ B/p65因子、Caspase-3及其下游凋亡相关因子Bcl-2、Bax的表达进行了分析;此外，建立了人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤模型，并对其进行腹腔给药，观察鸦胆子油乳、顺铂及其两者联合对人卵巢癌SKOV3肿瘤的生长抑制作用。同时对裸鼠的白细胞及血小板、肝肾功能(ALT、LDH、CR)进行了检测;采用电镜观察了肿瘤组织的病理学形态，并采用Western杂交分析了各组裸鼠整合素α-5及MRP-1/CD9的差异表达。主要研究结果如下：
　　1、鸦胆子油乳对卵巢癌SKOV3细胞生殖抑制作用随鸦胆子油乳药物浓度的提高和作用时间的延长而增强，成剂量-时间正效应关系。透射电镜观察SKOV3细胞超微结构变化，发现低、中浓度（25μg/mL、50μg/mL）的鸦胆子油乳可以引起细胞凋亡的早期改变，高浓度的（100μg/mL）可以引起细胞坏死。
　　2、相同作用时间下，鸦胆子油乳及顺铂两者联合对SKOV3细胞的抑制作用显著高于两者单独应用。随着药物作用时间延长，各药物组对人卵巢癌SKOV3细胞抑制率呈上升趋势。鸦胆子油乳与顺铂联合诱导人卵巢癌SKOV3细胞的凋亡作用显著高于两者单独作用，随着作用时间的延长，各药物组处理下的SKOV3细胞凋亡率逐渐增强。
　　3、鸦胆子油乳、顺铂及两者联合在诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡时，下调了NF-κB/p65因子、凋亡抑制基因Bcl-2的表达水平，上调了Caspase-3、促进凋亡基因Bax的表达水平。
　　4、成功建立了人卵巢癌SKOV3裸鼠原位移植瘤模型，并对其进行腹腔给药。结果表明鸦胆子油乳、顺铂及其两者联合均对人卵巢癌SKOV3裸鼠原位移植瘤的生长具有抑制作用，各组（每组8只）的抑瘤率分别为23.56±3.67％、42.57±3.45％、48.36±3.08％。相对于顺铂，鸦胆子油乳对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠白细胞及血小板、肝肾功能(ALT、LDH、CR)影响较小，呈低毒性。
　　5、应用电镜，观察了肿瘤组织的病理学形态，并采用Western blot分析了各组裸鼠整合素α-5及MRP-1/CD9的差异表达。组织切片可见，随着各处理对肿瘤细胞抑制作用的增强，各组肿瘤细胞由片状变性趋近于片状坏死，并可见凋亡小体。Westernblot显示各组裸鼠整合素α-5及MRP-1/CD9存在差异表达。与对照组比较，鸦胆子油乳组及顺铂组整合素、MRP1/CD9均呈现高表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　本研究首次提出鸦胆子油乳注射液联合顺铂腹腔给药治疗卵巢癌，分别从体外、体内实验对鸦胆子油乳注射液、顺铂及其两者联合腹腔给药对人卵巢癌SKOV3细胞及裸鼠移植瘤组织的生长抑制作用进行了研究，为其进一步临床应用提供了理论依据，为卵巢癌的治疗提供新方法、新思路。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 卵巢癌病因学和流行病学研究

1．3 肿瘤发生与细胞凋亡

1．3．1 细胞凋亡

1．3．2 细胞自噬

1．3．3 细胞凋亡相关因子

1．4 卵巢癌的治疗

1．4．1 卵巢癌的手术治疗

1．4．2 卵巢癌的化学治疗

1．4．3 卵巢癌的生物治疗

1．4．4 中药对卵巢癌的辅助治疗作用

1．5 腹腔热灌注化疗

1．5．1 腹腔热灌注化疗的理论基础

1．5．2 腹腔热灌注化疗用药

1．5．3 腹腔热灌注化疗给药方式

1．5．4 腹腔热灌注化疗注意事项

1．5．5 腹腔热灌注化疗在卵巢癌中的应用

1．5．6 中药腹腔灌注化疗应用

1．6 鸦胆子油乳抗肿瘤作用研究

1．6．1 鸦胆子油乳的抗肿瘤机制

1．6．2 鸦胆子油乳防治肿瘤的临床应用

1．7 本研究的目的和意义

2 鸦胆子油乳及其联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 试剂与仪器

2．2．3 实验方法

2．2．4 统计分析方法

2．3 结果与分析

2．3．1 鸦胆子油乳对SKOV3细胞的增殖抑制作用

2．3．2 鸦胆子油乳、顺铂及其两者联合对SKOV3细胞的增殖抑制作用

2．3．3 鸦胆子油乳对SKOV3细胞的形态学影响

2．3．4 鸦胆子油乳及其联合顺铂对SKOV3细胞的凋亡作用

2．4 讨论

2．4．1 鸦胆子油乳及其联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞体外的生殖抑制作用

2．4．2 细胞凋亡的形态学特征

2．5 本章小结

3 鸦胆子油乳及其联合顺铂抑制人卵巢癌细胞SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡的机制研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 试剂与仪器

3．2．3 实验方法

3．2．4 统计分析方法

3．3 结果与分析

3．3．1 人卵巢癌细胞中NF-κB／P65、Caspase-3、Bcl-2及Bax基因的表达

3．3．2 人卵巢癌细胞中NF-κB／p65、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表达

3．4 讨论

3．4．1 Caspase-3与卵巢癌的相关性

3．4．2 NF-κB／p65因子的表达分析

3．4．3 Bcl-2与Bax的表达分析

3．5 本章小结

4 鸦胆子油乳及其联合顺铂对SKOV3裸鼠原位移植瘤生长的抑制作用

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验动物

4．2．2 试剂与仪器

4．3 实验方法

4．3．1 实验动物饲养管理

4．3．2 皮下移植瘤的制备

4．3．3 移植瘤模型的建立

4．3．4 动物分组及给药处理

4．3．5 实验观察指标

4．3．6 对血细胞及肝肾功能的影响

4．3．7 取材

4．4 统计分析方法

4．5 结果与分析

4．5．1 SKOV3裸鼠移植瘤模型的建立

4．5．2 药物干预对裸鼠及移植瘤的影响

4．5．3 不同药物干预对SKOV3裸鼠移植瘤生长的影响

4．5．4 不同药物干预对SKOV3裸鼠血细胞及肝肾功能的影响

4．6 讨论

4．6．1 人卵巢癌SKOV3裸鼠原位移植瘤模型建立成功的因素分析

4．6．2 鸦胆子油乳联合顺铂腹腔给药治疗卵巢癌的疗效性分析

4．7 本章小结

5 鸦胆子油乳及其联合顺铂对SKOV3裸鼠原位移植瘤MRP-1／CD9和整合素α-5表达的影响

5．1 引言

5．2 材料

5．2．1 实验材料

5．2．2 试剂与仪器

5．3 实验方法

5．3．1 组织形态学观察

5．3．2 人卵巢癌细胞中MRP-1／CD9和整合素α-5蛋白的表达

5．4 统计分析方法

5．5 结果与分析

5．5．1 组织形态学观察

5．5．2 卵巢癌模型鼠组织中MRP-1／CD9、整合素α-5的表达

5．6 讨论

5．7 本章小结

结论

论文创新点

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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