内生菌G22生产皂苷的特性及作为诱导子对人参培养根的影响

摘要

人参皂苷(Ginsenoside)是名贵中草药人参的主要药用成分，在医药行业具有重要价值。由于人参资源的紧缺，市场需求日益加大，导致人参皂苷供不应求。为提高人参皂苷产量，满足市场需求，本研究通过对产皂苷的龙牙楤木内生真菌G22发酵生产人参皂苷和利用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导G22提高皂苷积累量进行了相关的研究，同时探讨了G22作为诱导子及其与人参培养根共培养提高人参的产皂苷能力，为利用G22生产人参皂苷及作为诱导子诱导人参培养根皂苷合成量提供理论支持和进一步优化生产的技术指导。同时还建立了适用于G22和人参培养根的HPLC测定皂苷体系。
　　(1)高效液相色谱法(HPLC)体系的建立
　　为了同时测定人参培养根及内生真菌G22中10种人参皂苷单体的含量，建立了新的高效液相色谱法。液相体系如下，Waters Symmetry C18 Synergi色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm），柱温30℃，以乙腈为流动相A，超纯水为流动相B进行梯度洗脱，检测波长203 nm，进样量10μL，结果10种人参皂苷色谱峰基本分离，且线性关系、精密度、稳定性、重复性良好，其平均回收率在95.07％～108.72％之间。本实验方法快速简便，重现性好，可以对人参培养根及内生真菌G22中人参皂苷含量进行多指标质量控制。
　　(2)G22合成人参皂苷特性的研究
　　本研究选择常用的4种真菌培养基对G22产皂苷能力的影响，以确定G22产皂苷最佳培养基及最佳收获时间，同时研究诱导子MeJA对G22生产皂苷的影响。结果表明高氏Ⅰ号培养基为G22合成皂苷的最佳培养基，而Rb1、Rd的最佳生产培养基为马丁氏培养基。总体上看MeJA的添加会抑制G22总皂苷及单体皂苷的合成，但某一浓度的MeJA会针对性的提高Rg1、Rg3、F2的产量，如Rg1在100μmol/L MeJA诱导下产量最多，Rg3在50μmol/L MeJA诱导下积累量最大，而F2在本实验诱导条件下还未达到合成最大值，需进一步探索。
　　(3)G22与人参培养根共培养，G22为诱导子对人参培养根皂苷合成的影响
　　本研究主要探讨G22提高人参培养根的产皂苷能力，达到低成本大规模生产人参皂苷的目的。通过G22作为与人参培养根共培养实验发现，G22与人参培养根共培养会抑制人参生物量的积累，300μL菌液对人参总皂苷、Rb1、Rh2的诱导促进作用最大，产量分别达到了13.69 mg/g、0.33 mg/g、0.05 mg/g。
　　通过诱导子诱导实验可知，本实验中诱导子的添加会抑制人参培养根的生长但能促进总皂苷的合成，100μm/L MeJA+灭菌菌体0.3 g诱导子为提高皂苷产量降低成本的最适诱导子。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景及依据

1．2 内生菌

1．2．1 概述

1．2．2 药用植物内生真菌

1．2．3 产皂苷内生真菌

1．2．4 选择G22进行研究的目的及意义

1．3 人参皂苷

1．3．1 概述

1．3．2 皂苷的合成途径

1．3．3 皂苷的药理活性

1．4 诱导子

1．4．1 诱导子概述

1．4．2 茉莉酸甲酯诱导子

1．4．3 内生真菌诱导子

1．5 高效液相色谱法

1．6 研究目的及意义

2 测定人参培养根及内生菌G22皂苷含量的高效液相色谱法

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 实验材料来源

2．2．2 实验药剂

2．2．3 培养基配方

2．2．4 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 培养基配制

2．3．2 人参培养根的培养

2．3．3 内生真菌G22的复活与扩繁

2．3．4 人参培养根中皂苷的提取

2．3．5 内生真菌G22中皂苷的提取

2．3．6 建立HPLC测定体系

2．4 结果与分析

2．4．1 线性关系的考察

2．4．2 精密度实验

2．4．3 重复性实验

2．4．4 稳定性实验

2．4．5 回收率实验

2．4．6 样品测定

2．5 讨论

2．5．1 指标的选择

2．5．2 液相条件的选择

2．6 本章小结

3 内生真菌G22生产皂苷及作为诱导子对人参培养根产皂苷的影响

3．1 引言

3．2 材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 培养基配方

3．2．4 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 培养基配制

3．3．2 内生真菌G22培养及生长量测定

3．3．3 MeJA诱导G22皂苷生产

3．3．4 G22与人参共培养

3．3．5 G22诱导子诱导人参培养根

3．4 结果与讨论

3．4．1 内生真菌G22不同时间不同培养基对皂苷合成的影响

3．4．2 MeJA诱导子对G22生产皂苷的影响

3．4．3 内生真菌G22与人参共培养对皂苷合成的影响

3．4．4 内生真菌G22作为诱导子对人参培养根生产皂苷的影响

3．5 讨论

3．5．1 培养基的选择

3．5．2 MeJA诱导G22产皂苷最适浓度的选择

3．5．3 诱导人参培养根生产皂苷的最佳诱导子的选择

3．6 小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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