茄子萼片花青素合成相关基因DFR和MYB的克隆及表达分析

摘要

茄子（Solanum melongena L.）作为大众餐桌上即为常见的菜，其富含大量花青素，具有很高的营养价值，其根、茎、叶和种子具有一定药用价值，其萼片也经常出现在餐桌上，具有很好的市场前景。
　　本研究针对于欧洲绿萼茄，东北紫茄，及其两种茄子的杂交茄观察后发现，欧洲进口茄萼片整个生长周期内均为绿色，东北紫茄则随生长周期的推进，逐渐变为萼片全紫，而杂交品种则随生长周期，萼片也逐渐变紫，但并非全为紫色，而是紫、绿相间。本实验针对萼片为何会出现该种变化进行了如下研究及结果分析:
　　1.选择三种茄子生长成熟的果实萼片作为实验材料。分别为全绿的欧洲绿萼品种茄子，东北紫萼品种茄子，及其绿、紫相间的杂交品种。采用RACE及同源克隆的方法分别克隆了这三个品种茄子DFR及MYB6个基因的cDNA，命名为SmDFR和SmMYB。
　　2.DFR和MYB基因分析
　　欧洲绿萼SmDFR基因cDNA全长1016bp，从82bp-716bp为开放阅读框，编码213个氨基酸，登录号为KX224250;东北紫萼SmDFR基因cDNA全长1128bp，从332bp-973bp为开放阅读框，共213个氨基酸，登录号为KX224251;杂交品种SmDFR基因cDNA全长1005bp，从73bp-708bp为开放阅读框，共211个氨基酸，登录号为KX224252。欧洲绿萼SmMYB基因cDNA全长969bp，从116bp-578bp为开放阅读框，共编码153个氨基酸，登录号为KX224253;东北紫萼SmMYB基因cDNA全长959bp，从178bp-621bp为开放阅读框，编码153个氨基酸，登录号为KX224254;杂交品种SmMYB基因cDNA全长993bp，从140bp-582bp为开放阅读框，编码153个氨基酸，登录号为KX224255。
　　3.采集萼片，对三个品种现蕾期、盛蕾期、初花期，盛花期4个时期的花青素含量进行测定。检测结果表明，欧洲绿萼品种花青素含量无明显变化;而东北紫萼则随生长周期推进，花青素含量明显升高;杂交品种的花青素含量则处于上述二者之间，与观察到的萼片紫色变化程度成正相关，但又并非完全符合肉眼观察的颜色变化，其中可能与pH值等诸多因素有关。荧光定量PCR结果表明，DFR及MYB的表达水平变化与其花青素含量正相关。
　　证实三个品种中萼片颜色及花青素含量变化与DFR及MYB的表达模式及表达量成正相关。但由于前期试验所得结果，所得氨基酸比对差异并不大，而表达量差异则有明显异，故推断可能与该基因的启动子有关，调控这些基因呈现出该种变化，而且所得的这两种基因均与光信号调控有关，亦有可能受光照影响而至。
　　4.为了进一步验证SmMYB基因的作用，利用GATEWAY技术对三个品种种的SmMYB进行了拟南芥过表达转基因实验。

目录

摘要

绪论

1．1 引言

1．1．1 欧洲绿萼茄

1．1．2 东北紫萼茄

1．1．3 杂交茄

1．2 花青素概述

1．2．1 花青素的合成途径

1．2．2 花青素的生理功能及作用机理

1．2．3 二氢黄酮醇4-还原酶(Dihydroflavonol 4-Reductase，DFR)的研究

1．2．4 MYB转录因子的研究

1．3 研究的目的及意义

1．4 研究的方法与技术路线

1．4．1 研究方法

1．4．2 技术路线

2 三种茄子中花青素合成途径中相关基因的克隆

2．1 三种茄子的DFR和MYB基因保守区域的克隆

2．1．1 试验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 试验方法

2．1．4 结果与分析

2．2 茄子DFR、MYB基因5’ RACE片段克隆

2．2．1 试验材料

2．2．2 试验试剂

2．2．3 试验方法

2．2．4 结果与分析

2．3 茄子DFR，MYB基因全长的获得

2．3．1 试验材料

2．3．2 试验试剂

2．3．3 试验方法

2．3．4 试验结果与分析

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 三种茄子DFR、MYB基因特征及系统进化分析

3．1 三种茄子DFR、MYB基因的序列特征分析

3．1．1 欧洲DFR基因序列结构分析及结构预测

3．1．2 东北DFR基因序列结构分析及结构预测

3．1．3 杂交DFR基因序列结构分析及结构预测

3．1．4 欧洲MYB基因序列结构分析及结构预测

3．1．5 东北MYB基因序列结构分析及结构预测

3．1．6 杂交MYB基因序列结构分析及结构预测

3．2 茄子DFR及MYB基因的同源性分析与系统进化分析

3．2．1 茄子DFR基因的同源性分析与系统进化分析

3．2．2 茄子MYB基因的同源性分析与系统进化分析

3．3 讨论

3．4 本章小结

4 三种茄子中DFR、MYB基因的Realtime PCR

4．1 试验材料

4．2 试验试剂与仪器

4．3 试验方法

4．3．1 三种茄子四个生长时期萼片总RNA的提取

4．3．2 Realtime PCR模板cDNA的合成

4．3．3 Realtime PCR引物的设计

4．3．4 三种茄子中DFR，MYB基因的Realtime PCR检测

4．4 结果与分析

4．4．1 三种茄子DFR基因的Realtime PCR结果分析

4．4．2 三种茄子MYB基因的Realtime PCR结果分析

4．5 讨论

4．6 本章小结

5 三种茄子萼片的花青素含量测定

5．1 三种茄子四个不同生长期的花青素含量测定

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验试剂

5．1．3 试验方法

5．2 试验结果与分析

5．2．1 三种茄子四个时期花青素含量结果

5．3 讨论

5．4 本章小结

6 三种茄子的MYB基因的转基因植株

6．1 试验材料

6．1．1 试验试剂

6．2 试验方法

6．2．1 三种茄子中3个MYB基因全长的扩增

6．3．1 农杆菌介导的拟南芥遗传转化

6．4．1 蘸花法法遗传转化拟南芥

6．5 试验结果

6．5．1 基因利用attB-GENE-F／R引物进行PCR

6．5．2 农杆菌菌液PCR

6．6 讨论

6．7 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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