NaHCO3胁迫下吉尔吉斯白桦转录组分析及BkGRAS2基因的遗传转化

摘要

GRAS蛋白家族是一种植物特有的转录因子家族，该家族包含八个亚族:HAM、DELLA、PAT1、SCR、SHR、LISCL、LS和SCL3。GRAS蛋白一般由400-700个氨基酸构成，其C末端是保守的、N末端是可变的。GRAS家族成员在植物的生长与发育、信号转导、生物胁迫、非生物胁迫中发挥重要的作用。本研究结合白桦(吉尔吉斯白桦，缩写为Bk)的转录组数据和GRAS蛋白家族的特征，筛选出19个BkGRAS家族成员，对其进行生物信息学分析，成功地从吉尔吉斯白桦中隆了BkGRAS2基因，并对其进行了盐胁迫下表达模式验证、亚细胞定位、转化拟南芥，得到的结果如下:
　　在吉尔吉斯白桦盐胁迫转录数据分析中，筛选出与非生物胁迫相关的13类转录因子家族:GRAS、WRKY、Zinc finger protein、NAC、MYB、bHLH、HSF、MADS、ERF、bZIP、AP2、ARF和HD-ZIP等。本研究主要对GRAS家族成员进行研究。
　　吉尔吉斯白桦GRAS家族的生物信息学分析鉴定出19个BkGRAS蛋白均含有典型的LHRⅠ、VHIID、LHRⅡ、PFYRE和SAW结构域;蛋白质二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主;主要定位于细胞核、细胞质或叶绿体，有趣的是BkGRAS2蛋白在细胞核和细胞质中均有定位。系统进化树表明19个BkGRAS蛋白主要分布于HAM、LISCL、AtPAT1、AtSCL3、DELLA和AtSCR六个亚族。
　　从吉尔吉斯白桦中成功地克隆了BkGRAS2基因，ORF全长为1614bp，编码537个氨基酸，其VHIID基序中P-N-H-D-Q-L残基是绝对保守的，SAW基序含有R-E、W-G和W-W三对绝对保守的残基。BkGRAS2基因和已发表的BkGRAS1基因有7个碱基差异，4个氨基酸变化，两个基因具有较高的相似性。从家族分析的系统进化树结果可知，BkGRAS2蛋白属于AtPAT1亚族。与其他双子叶植物一样，BkGRAS2基因偏好使用以A或U结尾的密码子。
　　半定量PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明BkGRAS2基因在根、茎和叶中均有表达，且表达量依次升高;胁迫12h时BkGRAS2基因在根中的表达量显著增高，说明根对0.6％ NaHCO3胁迫较为敏感;与对照组相比(0h)，胁迫24h时BkGRAS2基因在根、茎、叶中的表达量均降低，对0.6％ NaHCO3胁迫有一个适应的过程;而在胁迫48h时，BkGRAS2基因在茎和叶中的表达量达到最大值。
　　由亚细胞定位结果可知，在转化pBI121-BkGRAS2-GFP蛋白的洋葱表皮细胞的细胞核和细胞质中均可见到绿色荧光，表明BkGRAS2蛋白在细胞核和细胞质中均有定位。
　　在1mmol/L和4mmol/L NaHCO3胁迫下转基因株系种子的萌发率高于WT，转化株系的表型要好于WT，表明BkGRAS2基因能够对NaHCO3胁迫做出一定的响应，且能够提高转基因拟南芥对NaHCO3的耐受性。幼苗期的NaHCO3抗性实验表明，在低浓度NaHCO3(1mmol/L)高浓度NaHCO3(4mmol/L)处理下，转化子的根长长于WT，说明BkGRAS2基因能够提高转基因拟南芥对NaHCO3的耐受性，并且降低NaHCO3对转基因拟南芥的毒害作用。

目录

摘要

1 绪论

1．1 植物非生物胁迫

1．2 植物转录因子

1．3 植物GRAS家族转录因子

1．3．1 GRAS家族转录因子的结构与特征

1．3．2 GRAS家族成员在不同物种中的数目

1．3．3 GRAS家族的功能研究

1．4 选题的目的意义

2 NaHCO3胁迫下吉尔吉斯白桦基因表达谱的建立与初步分析

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 转录测序产量与组装产量统计

2．3．2 Unigene功能注释

2．3．3 Unigene的GO分类

2．3．4 Unigene的COG分类图

2．3．5 Unigene的差异表达分析

2．3．6 差异Unigene的pathway分析

2．3．7 关键转录因子的筛选

2．4 本章小结

3 吉尔吉斯白桦GRAS基因家族的生物信息学分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 吉尔吉斯白桦GRAS蛋白理化性质分析

3．2．2 吉尔吉斯白桦GRAS蛋白的结构域分析

3．2．3 吉尔吉斯白桦GRAS蛋白的二级结构预测

3．2．4 吉尔吉斯白桦GRAS蛋白跨膜结构、信号肽和亚细胞定位分析

3．2．5 吉尔吉斯白桦GRAS蛋白的系统进化树分析

3．3 本章小结

4 吉尔吉斯白桦BkGRAS2基因克隆及生物信息学分析

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株与载体

4．1．3 主要试剂和培养基

4．1．4 实验仪器

4．1．5 引物合成与测序

4．2 实验方法

4．2．1 吉尔吉斯白桦叶片总RNA的提取、DNA消化与cDNA合成

4．2．2 吉尔吉斯白桦BkGRAS2基因的克隆

4．2．3 吉尔吉斯白桦BkGRAS2基因的生物信息学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 总RNA的提取

4．3．2 吉尔吉斯白桦BkGRAS2基因的克隆

4．3．3 吉尔吉斯白桦BkGRAS2基因的生物信息学分析

4．4 本章小结

5 吉尔吉斯白桦BkGRAS2基因的表达模式分析

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 主要试剂及仪器

5．2 实验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 吉尔吉斯白桦BkGRAS2基因的RT-PCR和qRT-PCR

5．4 本章小结

6 吉尔吉斯白桦BkGRAS2蛋白的亚细胞定位

6．1 实验材料

6．1．1 植物材料

6．1．2 菌株和载体

6．1．3 主要试剂和仪器

6．2 实验方法

6．2．1 pBI121-BkGRAS2-GFP载体构建

6．2．2 基因枪(PDS-1000)轰击法进行亚细胞定位

6．3 结果与分析

6．4 本章小结

7 吉尔吉斯白桦BkGRAS2基因的遗传转化

7．1 实验材料

7．1．1 植物材料

7．1．2 主要试剂

7．1．3 实验仪器

7．2 实验方法

7．2．1 植物表达载体pROKⅡ-BkGRAS2的构建

7．2．2 拟南芥的栽培及管理

7．2．3 拟南芥的遗传转化(浸花法)

7．2．4 转pROKⅡ-BkGRAS2基因拟南芥的鉴定

7．2．5 转pROKⅡ-BkGRAS2基因拟南芥的NaHCO3抗性分析

7．3 结果与分析

7．3．1 植物表达载体pROKⅡ-BkGRAS2的构建及鉴定

7．3．2 转pROKⅡ-BkGRAS2基因拟南芥的卡那霉素筛选和纯合子的鉴定

7．3．3 转pROKⅡ-BkGRAS2基因拟南芥的PCR鉴定

7．3．4 转pROKⅡ-BkGRAS2基因的拟南芥株系的实时荧光定量PCR分析

7．3．5 转pROKⅡ-BkGRAS2基因的拟南芥株系的NaHCO3抗性分析

7．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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