果蝇Rgn蛋白多克隆抗体制备及其在天然免疫中的作用

摘要

天然免疫作为多细胞生物阻止外界微生物入侵的第一道防线，在机体防御机制中具有十分重要的作用。与哺乳动物相比，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的天然免疫系统没有与之相似的B淋巴细胞及T淋巴细胞，也没有能够专一识别病原微生物的特异性免疫系统，但其能够对微生物感染迅速而有效地应答，说明果蝇具有能够抵抗病原微生物入侵的高效的固有免疫系统。日前的研究结果表明，果蝇体内存在着三种主要的天然免疫方式:分别是通过脂肪体产生的抗菌肽来达到防御目的体液免疫，依靠浆细胞吞噬和包裹作用的细胞免疫，以及通过产生的黑色素沉积在伤口并杀伤病原体的黑化反应。
　　再生蛋白(Regeneration，Rgn)是C型凝集素(C-type lectin)超家族成员之一，由一段信号序列和C型钙离子依赖性凝集素结构域(C-type Ca2+-dependent lectindomain，CTLD)组成，是rgn基因的编码产物。研究表明，Rgn蛋白对于个体发育、组织再生和创伤修复具有重要作用。其参与果蝇生长发育的各阶段，是果蝇生长发育中不可或缺的重要蛋白之一。因Rgn蛋白在果蝇生长发育中的重要作用以及rgn基因所含有的特殊的C型凝集素结构域，推测其可能也参与了果蝇的天然免疫反应。本实验通过比较野生型WT(w1118)与rgn缺陷型果蝇（gnRNAi）腹腔注射白假丝酵母菌孢子后生存率的变化认识到由于Rgn蛋白的缺失，造成机体抵御真菌的能力明显减弱;血细胞含量的比较实验中出现血细胞数量明显升高的现象;此外，在生长状态的比较中也观察到了全身低表达蛹期致死及翅原基低表达导致翅脉异常发育的现象。这都说明由于Rgn蛋白的缺失导致果蝇机体出现了部分天然免疫功能的改变。同时本实验对rgn缺陷型果蝇细胞的吞噬能力、细胞膜肌动蛋白延展性以及创伤引起的黑化反应能力进行探究，与对照相比未出现明显变化。
　　此外通过制备Rgn蛋白的多克隆抗体将从蛋白水平对Rgn蛋白进行检测，能够更加直接、准确的揭示其细胞定位及表达情况，为研究果蝇Rgn蛋白的生物学功能提供研究基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 果蝇及其在生物研究中的作用

1．1．1 模式生物果蝇

1．1．2 果蝇中的RNA干涉技术——UAS／Gal4系统

1．1．3 果蝇中的P因子技术

1．2 果蝇的天然免疫

1．2．1 果蝇的体液免疫

1．2．2 果蝇的细胞免疫

1．2．3 果蝇的黑化反应

1．2．4 果蝇体内其它免疫方式

1．3 Rgn蛋白介绍

1．4 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 果蝇品系

2．1．2 实验菌种及载体

2．1．3 实验试剂

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 制作果蝇培养基

2．2．2 果蝇成虫RNA提取

2．2．3 构建重组表达质粒

2．2．4 融合蛋白的原核诱导及纯化

2．2．5 Western blot法检测Rgn蛋白的表达

2．2．6 Rgn蛋白多克隆抗体制备

2．2．7 细胞转染

2．2．8 免疫组织化学染色检测Rgn蛋白在果蝇血细胞中定位

2．2．9 果蝇三龄幼虫血细胞计数

2．2．10 果蝇三龄幼虫噬菌实验

2．2．11 果蝇病原体注射实验

2．2．12 果蝇三龄幼虫创伤实验

2．2．13 果蝇三龄幼虫血细胞细胞膜延展实验

2．2．14 图像采集

3 结果与分析

3．1 抗Rgn多克隆抗体的制备

3．1．1 pRSETA-rgn表达载体的构建

3．1．2 原核表达及蛋白纯化

3．1．3 抗Rgn多克隆抗体特异性检测

3．2 Rgn蛋白在果蝇天然免疫中的作用

3．2．1 检测rgn缺陷型果蝇体内Rgn含量

3．2．2 Rgn对果蝇生长发育的影响

3．2．3 rgn缺陷型果蝇血细胞数量分析

3．2．4 rgn缺陷型果蝇侵染病原体生存率分析

3．2．5 rgn缺陷型果蝇血细胞对TRITC-bead的吞噬实验

3．2．6 rgn缺陷型果蝇血细胞细胞膜肌动蛋白形态检测

3．2．7 rgn缺陷型果蝇淋巴腺中PPO1含量变化

3．2．8 rgn缺陷型果蝇创伤修复实验

4 讨论

4．1 抗Rgn多克隆抗体

4．2 实验中所用果蝇的杂交策略

4．3 Rgn蛋白对于果蝇细胞免疫及造血功能的影响

4．4 Rgn蛋白在抵御病原微生物入侵时的作用

4．5 Rgn蛋白对果蝇血细胞非病原体吞噬及摄取机制

4．6 Rgn蛋白对果蝇黑化反应及创伤修复的影响

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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