rgn基因在果蝇肠道免疫和天然免疫中的功能研究

摘要

果蝇不具有类似哺乳动物的获得性免疫系统，肠道免疫和天然免疫是果蝇抵抗病原微生物的主要免疫防御机制。肠道免疫用于抵抗通过口部进食等途径侵入体内的病原体，主要过程包括肠道抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)的分泌和活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的清除作用。果蝇肠道免疫又可划分为两个层面，即对于病原体的清除和对于病原体侵入造成肠道细胞损伤的修复。天然免疫针对于通过表皮或伤口等侵入果蝇体内的病原体，主要过程包括由血细胞参与的吞噬、包裹和黑化作用以及由体液免疫诱导的抗菌肽表达。目前，关于果蝇肠道免疫和天然免疫的作用方式已经有了较为清晰的阐明，但涉及到这些免疫途径的关键基因，以及这些基因如何参与到一些关键的信号通路中协同发挥作用还需要更为深入的研究。
　　在前期的研究中发现，rgn基因低表达突变体果蝇血细胞对于真菌孢子的吞噬存在缺陷。并有报道表明rgn蛋白序列的N末端含有一段C-型凝集素结构域，C-型凝集素的功能涉及到胞外基质形成、内吞作用、补体激活、病原识别和细胞与细胞的相互作用等。rgn在哺乳动物中的同源物Reg也被证明参与小鼠肠道干细胞的增殖。因此，推测rgn基因在果蝇肠道免疫和天然免疫中起作用。
　　本研究主要以野生型果蝇w1118(WT)和rgn低表达突变体（rgn G4035）果蝇为研究材料，通过喂食SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠）和病原体、形态学观察、免疫染色、血细胞计数、注射荧光病原体和RT-qPCR等方法，对果蝇的生存率、肠道细胞凋亡和干细胞分化、血细胞功能以及抗菌肽表达等方面进行了研究。所获得的主要研究结果如下：
　　1.通过PCR的方法确定了rgnG4035果蝇突变体的P因子插入位点在rgn基因ATG上游的-590 bp处，并通过RT-qPCR验证了rgnG4035果蝇为rgn mRNA低表达突变体。
　　2.rgnG4035和rgnRNAi果蝇喂食SDS和DSS（dextran sulfate sodium，葡聚糖硫酸钠）后与对照相比生存率显著降低。
　　3.喂食SDS后，果蝇肠道长度明显缩短;rgnG4035果蝇肠道相对于WT出现严重的黑色素瘤和更多的坏死细胞;rgnG4035和rgnRNAi果蝇在肠道干细胞的分化上存在缺陷。
　　4.喂食SDS后果蝇肠道ROS水平明显升高，但WT和rgnG4035果蝇之间不具有显著性差异;果蝇肠道抗菌肽表达量显著升高，虽然rgnG4035相对于WT果蝇在抗菌肽诱导表达的时间上表现出一定的延迟，但对于肠道感染的病原体不表现出更高的敏感性。
　　5.果蝇幼虫造血功能分析结果表明rgnG4035果蝇体内浆细胞分化异常;病原微生物刺激rgnG4035果蝇后薄层细胞的分化有缺陷;WT和rgn4035果蝇三龄幼虫的晶细胞数无显著差异;rgnG4035果蝇对荧光孢子spore-Alexa Flour488的吞噬存在缺陷，幼虫造血功能的异常可能影响果蝇的细胞免疫功能。
　　6.WT和rgnG4035果蝇腹腔注射真菌孢子感染后体内抗菌肽诱导表达量都明显升高，但两者不具有显著性差异。
　　综上所述，在果蝇肠道免疫方面，rgn基因主要参与肠道细胞损伤的修复和细胞更新，以维持肠道细胞的稳态;在天然免疫方面，rgn基因影响果蝇的造血功能和血细胞对病原体的吞噬功能。本研究为揭示果蝇以及哺乳动物肠道免疫和天然免疫机制提供了良好的理论基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 果蝇及其在生物学研究中的应用

1．2．1 模式生物黑腹果蝇

1．2．2 果蝇中的P因子

1．2．3 基于GAL4/UAS二元表达系统在果蝇中实现RNA干扰

1．3 果蝇肠道免疫研究进展

1．3．1 果蝇肠道基本结构和功能

1．3．2 果蝇肠道免疫应答

1．4 果蝇天然免疫研究进展

1．4．1 果蝇细胞免疫

1．4．2 果蝇体液免疫

1．5 果蝇rgn基因及其研究现状

1．6 本研究的目的和意义

2 rgn基因在果蝇肠道免疫中的功能研究

2．1 材料方法

2．1．1 果蝇品系

2．1．2 实验菌种

2．1．3 果蝇培养基的配制

2．1．4 果蝇保种及处女蝇的挑选

2．1．5 果蝇杂交策略

2．1．6 主要实验试剂

2．1．7 所用生物学辅助软件及网上数据资源

2．1．8 主要实验仪器

2．1．9 果蝇基因组DNA提取

2．1．10 RT-PCR

2．1．11 Real-time PCR

2．1．12 果蝇喂食SDS和DSS的生存率实验

2．1．13 果蝇肠道黑化统计

2．1．14 果蝇肠道7-AAD染色

2．1．15 果蝇肠道Caspase 3和PH3染色

2．1．16 果蝇肠道DHE染色

2．1．17 果蝇喂食病原微生物生存率实验

2．2 技术路线

2．3 结果与分析

2．3．1 果蝇突变体的验证

2．3．2 rgn基因在rgnG4035突变体三龄幼虫各个组织中的表达情况

2．3．3 rgn突变体果蝇喂食SDS和DSS后的生存率统计

2．3．4 SDS诱导肠道细胞的黑化

2．3．5 SDS诱导肠道细胞的死亡

2．3．6 喂食SDS后肠道细胞的凋亡情况

2．3．7 喂食SDS后肠道干细胞的分化情况

2．3．8 SDS诱导肠道ROS水平的升高

2．3．9 喂食SDS后果蝇肠道抗菌肽的表达

2．3．10 rgnG4035果蝇喂食病原微生物的生存率

2．3．11 果蝇喂食SDS后诱导肠道中rgn表达量升高

2．3．12 基于rgn在各个物种中同源物的氨基酸序列构建进化树

2．4 讨论

2．5 小结

3 rgn基因在果蝇天然免疫中的功能研究

3．1 材料方法

3．1．1 果蝇杂交策略

3．1．2 主要实验试剂

3．1．3 所用试剂的配制

3．1．4 果蝇各个时期的收集

3．1．5 果蝇三龄幼虫血细胞分析

3．1．6 荧光孢子的制作

3．1．7 体内血细胞吞噬实验

3．1．8 果蝇对病原微生物感染的生存率实验

3．2 技术路线

3．3 结果与分析

3．3．1 果蝇不同发育时期和不同组织中rgn mRNA表达量情况

3．3．2 rgnG4035果蝇幼虫造血功能分析

3．3．3 果蝇成虫对荧光病原体的吞噬能力

3．3．4 果蝇三龄幼虫血细胞对FITC-bead的吞噬

3．3．5 果蝇成虫对India ink的吞噬能力

3．3．6 真菌感染后rgnG4035果蝇体内抗菌肽的表达

3．3．7 rgnG4035果蝇注射感染病原体后的生存率

3．3．8 利用P因子不完全去除的方法获得完全突变体果蝇

3．4 讨论

3．5 小结

结论

展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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