SmWRKY28蛋白参与蒙古柳抗NaCl、NaHCO3胁迫的调节功能研究

摘要

WRKY基因家族是一类典型的能够编码转录调控因子的基因家族。目前已知WRKY基因的功能广泛地涉及植物对逆境胁迫的响应及植物保护、结构发育等过程。WRKY基因能被多种生物和非生物胁迫因子诱导不同程度的表达。蒙古柳WRKY蛋白基因与抗盐碱性相关的功能研究未见报道。本研究利用RT-PCR技术从蒙古柳cDNA中克隆到了一个开放阅读框(ORF)为1425bp，编码475个氨基酸的序列，经BLAST比对确定其含有一个WRKY结构，系统进化树表明其与毛果杨的WRKY28基因同源性最高。所以命名为SmWRKY28。
　　实时荧光定量PCR检测到Sm WRKY28基因在蒙古柳的根、茎、叶、花、雌雄花均有表达，且雌性植株较雄性植株高;Northern blot分析表明SmWRKY28在150mMNaCl、30mM NaHCO3、100μM Me-JA处理下随着胁迫时间的延长表达量也随之增加，但30mM NaHCO3处理48h是表达量最明显。
　　将35S-Sm WRKY28-GFP融合基因通过基因枪导入洋葱表皮细胞，荧光显微镜下观察显示其融合蛋白在细胞核中行使其功能;小量诱导优化pGEX-6p-3-SmWRKY28在宿主BL21中原核蛋白的表达条件，表明在1mM IPTG下的最佳诱导时间为5h。GST-Sm WRKY28融合蛋白大量诱导纯化得到以包涵体的形式稳定存在，约为78kD。
　　通过过表达SmWRKY28基因的拟南芥萌发后期抗性分析实验表明，在80、100、150mM NaCl和2、4、6mM NaHCO3及15、30、75μM Me-JA的1/2MS平板上过表达Sm WRKY28的拟南芥长势优于野生型，表现出了较强的抗盐碱性，并且在NaCl胁迫下过表达SmWRKY28基因的拟南芥的鲜重比野生型高，但MDA(丙二醛)含量低于野生型，说明SmWRKY28基因与抗盐碱性有关，并且提高了植株的抗氧化能力。在NaHCO3胁迫下过表达SmWRKY28的拟南芥的叶绿素含量和鲜重都优于野生型，进一步说明了Sm WRKY28转录调控因子与抗盐碱性有关。
　　通过农杆菌介导法将gus基因转入蒙古柳，以及gus染色证明转基因蒙古柳具有β-半乳糖苷酶活性，建立蒙古柳的遗传转化体系，为进一步解析SmWRKY28基因的功能准备了材料可用于分子植物育种，为创造抗逆的新品系打下了基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 转录因子

1．3 WRKY蛋白的研究进展

1．3．1 WRKY蛋白的结构特征与分类

1．3．2 WRKY转录因子的多样化功能

1．4 本研究的目的和意义

2 SmWRKY28基因的克隆及表达特性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 SmWRKY28基因的克隆及生物信息学分析

2．2．2 SmWRKY28基因的mRNA不同组组织器官的表达特性分析

2．2．3 SmWRKY28基因不同时间胁迫下特异性表达分析

2．3 本章小结

3 蒙古柳WRKY28蛋白的亚细胞定位

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 SmWRKY28蛋白亚细胞定位预测

3．2．2 SmWRKY28-GFP融合蛋白的亚细胞定位

3．3 本章小结

4 过表达SmWRKY28基因拟南芥的抗NaCl、NaHCOs、Me-JA胁迫分析

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 二元植物表达载体的构建

4．2．2 过表达SmWRKY28基因拟南芥的鉴定

4．2．3 过表达SmWRKY28基因拟南芥的抗盐性分析

4．2．4 过表达SmWRKY28基因拟南芥的抗碱性盐分析

4．2．5 过表达SmWRKY28基因拟南芥的抗Me-JA分析

4．3 本章小结

5 农杆菌介导蒙古柳叶愈伤组织诱导及其遗传转化体系

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 再生体系的建立

5．1．3 遗传转化体系的建立

5．2 结果与分析

5．2．1 蒙古柳再生体系的建立

5．2．2 蒙古柳愈伤组织的遗传转化

5．3 本章小结

6 蒙古柳SmWRKY28蛋白的大肠杆菌原核表达

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 原核表达载体pGEX-6p-3-SmWRKY28的构建及鉴定

6．2．2 重组蛋白GST-SmWRKY28在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

6．3 本章小结

7 讨论

7．1 SmWRKY28基因的生物信息及表达特性分析

7．2 SmWRKY28蛋白的亚细胞定位

7．3 SmWRKY28基因在逆境胁迫下的表型分析

7．4 SmWRKY28融合蛋白的诱导及纯化

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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