miR-17-92基因簇microRNAs对胰腺细胞的调控

摘要

哺乳动物胰腺是由内、外分泌部组成的混合腺。内分泌部胰岛分泌胰高血糖素、胰岛素等入血调节靶器官代谢，尤其对维持机体葡萄糖稳态发挥重要作用，胰岛β细胞结构和功能异常诱发动物和人类糖尿病。外分泌部腺泡细胞主要分泌消化酶到十二指肠消化食物，外分泌细胞功能异常导致营养代谢缺陷。深入研究胰腺组织形成机理和细胞功能调控有助于更好地理解胰腺疾病发病原因，为胰腺相关疾病治疗提供依据。
　　胰腺芽基起源于早期内胚层，经过胰腺祖细胞增殖、分支形成、内外分泌细胞分化和细胞迁移聚集过程形成胰腺。胚胎胰腺祖细胞增殖、分化受Ptf1a、Ngn3等多种转录因子及信号通路调控。microRNAs(miRNAs)在个体发育和疾病发生方面起重要作用。miR-17-92基因簇编码miR-17、miR-20a、miR-18a、miR-19a、miR-19b和miR-92a六个miRNAs。近年来，miR-17-92基因簇成员在精子生成、神经、血管、肺泡形成方面功能逐渐被揭示，但对胰腺的调控了解较少。本论文探究了miR-17-92基因簇miRNAs对胰腺祖细胞和内、外分泌细胞的功能调控。
　　结果发现:
　　1.miR-17-92基因簇miRNAs对胰腺祖细胞的调控:家族成员分别转染胰腺祖细胞，通过细胞计数、CCK8、组织切片免疫荧光染色结果研究发现，miR-17-92基因簇成员中miR-18a明显抑制体外分离培养的胰腺祖细胞和胰芽外植体中祖细胞的增殖，miR-19b转染使细胞数量略有增加;EdU、流式细胞术和qPCR结果显示，miR-18a使胰腺祖细胞细胞周期阻滞在G1期，miR-18a抑制剂促进细胞周期向S期转换;qPCR和Western结果证实miR-18a通过靶向抑制CTGF和Nedd9失活AKT和ERK信号通路活性，抑制CyclinDs表达，促进P21和P27表达，抑制细胞增殖。细胞计数、CCK8和流式细胞术结果表明，miR-19b促进细胞周期向S期转换，miR-19b部分逆转miR-18a对胰腺祖细胞增殖的抑制作用，miR-18a和miR-19b之间有拮抗作用。胰腺祖细胞分化标志性基因的qPCR检测结果表明，miR-18a促进内分泌细胞分化关键转录因子Ngn3表达，miR-17和miR-20a促进外分泌细胞分化关键转录因子Ptf1a和消化酶基因amyalse和elastase表达。
　　2.miR-17-92基因簇miRNAs对腺泡细胞的调控:生物信息预测、双荧光素酶检测、qPCR和Western结果表明miR-17-92基因簇编码的miR-17、miR-20a和miR-18a靶向调控腺泡细胞关键转录因子Ptf1a，miR-17和miR-20a在转录水平促进Ptf1a表达，而miR-18a抑制Ptf1a表达，miR-17IN、miR-20aIN和miR-18aIN能抑制内源miRNAs对Ptf1a的调控作用。分析miR-17和mR-20a上调Ptf1a基因表达机制，分别构建靶位点单核苷酸bulge缺失和截短的Ptf1a3'UTR荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶报告系统检测发现，miR-17和miR-20a对Ptf1a基因的调控依赖于靶位点第4位单核苷酸bulge和靶位点以外的旁侧序列。QPCR、Western和ELISA结果表明，miR-17、miR-20a和miR-18a均通过调控Ptf1a影响外分泌基因表达和消化酶合成，miR-17、miR-20a促进amylase、CPA1基因表达和淀粉酶合成，miR-18a抑制amylase、CPA1基因表达和淀粉酶合成;ELISA结果表明，miR-17、miR-20a与miR-18a之间有拮抗作用，miR-17、miR-20a部分逆转miR-18a对淀粉酶合成的抑制作用。
　　3.miR-17-92基因簇miRNAs对β细胞的调控:通过生物信息预测、双荧光素酶检测、qPCR和Western方法证明内分泌细胞分化关键转录因子Ngn3是miR-17、miR-20a和miR-18a的靶基因，miR-17、miR-20a抑制Ngn3表达，miR-18a促进Ngn3表达。分析miR-18a上调Ngn3基因表达机制，分别构建靶位点插入单个胞嘧啶核糖核苷酸和截短的Ngn33'UTR荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶报告系统检测发现，miR-18a对Ngn3基因的调控依赖于种子序列与靶位点的结合和旁侧“CUUCUU”序列。QPCR、Western、ELISA结果表明，miR-18a促进体外培养β细胞胰岛素合成，miR-17和miR-20a对胰岛素合成均有一定的抑制作用，miR-17IN、miR-20aIN和miR-18aIN抑制内源miRNAs对胰岛素基因的调控。
　　通过上述研究结果得出以下结论:
　　1.miR-17-92基因簇成员对胰腺祖细胞增殖分化有调控作用。miR-18a通过靶向抑制CTGF和Nedd9，失活AKT和ERK信号通路活性，抑制胰腺祖细胞增殖，使细胞周期阻滞在G1期;而miR-19b促进细胞周期向S期转换。miR-19b和miR-18a之间有拮抗作用，miR-19b部分逆转miR-18a对胰腺祖细胞增殖的抑制作用。在胰腺祖细胞分化过程中，miR-18a促进胰腺内分泌分化关键基因Ngn3表达;而miR-17和miR-20a促进胰腺外分泌分化关键基因Ptf1a表达，促进外分泌消化酶基因amylase和elastase表达。
　　2.miR-17-92基因簇成员对腺泡细胞关键转录因子Ptf1a和淀粉酶合成有调控作用。其中miR-17和miR-20a促进Ptf1a表达及淀粉酶合成，而miR-18a抑制Ptf1a表达及淀粉酶合成。miR-17和miR-20a对Ptf1a基因的调控依赖于靶位点第4位单核苷酸bulge和靶位点以外的旁侧序列。miR-17、miR-20a与miR-18a之间有拮抗作用，miR-17、miR-20a部分逆转miR-18a对淀粉酶合成的抑制作用。
　　3.miR-17-92基因簇成员对内分泌细胞分化关键转录因子Ngn3和成熟β细胞胰岛素合成有调控作用。其中miR-17、miR-20a抑制Ngn3表达，miR-18a促进Ngn3表达。miR-18a对Ngn3基因的调控依赖于种子序列与靶位点的结合及靶位点旁侧“CUUCUU”序列。miR-18a促进体外培养的β细胞系胰岛素合成，而miR-17和miR-20a对胰岛素合成均有一定抑制作用。

目录

摘要

1．1 胰腺发育的调控

1．1．1 胰腺结构和功能

1．1．2 胰腺发育过程

1．2 microRNAs与胰腺发育和功能

1．2．1 miRNAs与胰腺细胞分化和增殖

1．2．2 miRNAs与胰岛素合成和分泌

1．2．3 miRNAs与胰腺外分泌功能

1．3．4 miR-17-92基因簇miRNAs成员

1．3．2 miR-17-92基因簇miRNAs对哺乳动物器官发育和肿瘤发生的调控

1．3．3 miR-17-92基因簇的转录调控和主要靶基因

1．3．4 miR-17-92基因簇miRNAs成员之间的协同与拮抗作用

1．4 本研究的目的和意义

2 miR-17-92基因簇miRNAs对胰腺祖细胞的调控

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物和细胞系

2．1．2 载体、miRNAs和siRNAs

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 胰腺祖细胞转染

2．2．3 胰腺祖细胞诱导分化

2．2．4 胚胎胰腺剥离

2．2．5 胰芽培养和转染

2．2．6 细胞计数

2．2．7 CCK8

2．2．8 EdU检测细胞增殖

2．2．9 流式细胞术检测细胞周期

2．2．10 细胞凋亡检测

2．2．11 总RNA提取和反转录

2．2．12 实时定量PCR

2．2．13 Western Blot

2．2．14 组织切片免疫荧光染色

2．2．15 靶基因预测

2．3．2 miR-17-92基因簇miRNAs对胰腺祖细胞增殖的影响

2．3．3 miR-18a抑制胰腺祖细胞增殖的机制

2．3．4 miR-17-92基因簇miRNAs对胰腺祖细胞增殖的拮抗作用

2．3．5 诱导胰腺祖细胞分化后miR-17-92基因簇miRNAs表达变化

2．3．6 miR-17-92基因簇miRNAs对胰腺祖细胞分化过程中基因表达的影响

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 miR-17-92基因簇miRNAs对腺泡细胞的调控

3．1 试验材料

3．1．1 细胞系

3．1．2 载体和miRNAs

3．1．3 主要试剂

3．2 试验方法

3．2．2 细胞转染

3．2．3 靶基因预测

3．2．4 载体构建

3．2．5 总RNA提取和反转录

3．2．6 实时定量PCR

3．2．7 Western Blot

3．2．8 荧光素酶报告基因检测

3．2．9 酶联免疫吸附试验

3．2．10 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．2 胰腺细胞Ptf1a基因的表达模式

3．3．3 miR-17、miR-20a和miR-18a对Ptf1a基因的调控

3．3．4 双荧光素酶报告系统验证靶基因

3．3．5 miR-17、miR-20a上调Ptf1a表达的分析

3．3．6 miR-17、miR-20a和miR-18a对胰腺淀粉酶合成的调控

3．3．7 miR-17、miR-20a和miR-18a对羧肽酶CPA1基因的调控

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 miR-17-92基因簇miRNAs对β细胞的调控

4．1 试验材料

4．1．1 细胞系

4．1．2 载体和miRNAs

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器

4．2 试验方法

4．2．1 细胞培养

4．2．2 细胞转染

4．2．3 靶基因预测

4．2．4 载体构建

4．2．5 总RNA提取和反转录

4．2．6 实时定量PCR

4．2．7 Western Blot

4．2．8 细胞免疫荧光染色

4．2．9 MIN6细胞内胰岛素提取

4．2．10 葡萄糖刺激的胰岛素释放实验

4．2．11 酶联免疫吸附试验

4．2．12 荧光素酶报告基因检测

4．2．13 统计学分析

4．3 实验结果

4．3．1 筛选miR-17-92基因簇调控的胰腺内分泌靶基因

4．3．2 荧光素酶报告系统验证靶基因

4．3．3 miR-17、miR-20a和miR-18a对Ngn3基因的调控

4．3．4 miR-18a上调Ngn3表达的初步分析

4．3．5 miR-17、miR-20a和miR-18a对β细胞胰岛素基因的调控

4．3．6 miR-17、miR-20a和miR-18a对胰岛素合成和分泌的调控

4．4 讨论

4．5 本章小结

结论

参考文献

英文缩写词表(Abbreviation)

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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