大蒜开花调控因子AsFUL和AsSVP的功能分析

摘要

大蒜（Allium sativum L.）为葱科（Alliaceae）葱属（Allium）草本蔬菜作物，在世界范围内广泛栽培，具很高的食用价值和经济价值。但由于花败育，现有栽培品种只能进行无性繁殖，成为开展大蒜遗传学研究及通过常规育种改良经济学性状的瓶颈。基于课题组之前的研究，已获得与大蒜开花相关的MADS-box基因AsSVP的全长序列，本研究以‘阿城紫皮’大蒜为试材，应用RACE方法克隆了大蒜另一个与开花相关的MADS-box基因AsFUL全长序列，运用生物信息学方法对基因的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发育分析，利用半定量RT-PCR和实时定量PCR对AsFUL、AsSVP基因在不同器官的表达模式进行分析。分别构建了AsFUL、AsSVP基因超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化转染拟南芥，经抗生素筛选并结合PCR、RT-PCR等分子鉴定，成功获得阳性转化株系并对其开花情况进行观察，旨在为揭示AsFUL、AsSVP基因在大蒜花发育中的功能，为诱导大蒜发育功能花、实现有性繁殖提供分子研究基础。研究结果如下：
　　1.应用RACE方法获得了包含完整开放阅读框的AsFUL基因全长cDNA序列。序列结构分析结果表明，AsFUL基因编码241个氨基酸，其氨基酸序列具有典型的MIKC型结构，多肽链的C末端含有A功能基因家族特有的基序。系统发育分析表明，AsFUL基因属于单子叶A功能基因中的FUL-like进化系。
　　2半定量RT-PCR和实时定量PCR分析结果表明，AsFUL基因在花器官中特异表达，在假茎和嫩叶中表达丰度较低，在其它营养器官中均不表达；AsSVP基因在各器官中均有表达，其中在营养器官根、假茎、嫩叶中高丰度表达，在花器官中表达丰度较低。
　　3.利用Gateway技术分别构建了AsFUL和AsSVP基因过表达载体，经PCR检测鉴定后将构建好的重组质粒表达载体pH7WG2D,1-AsFUL和pH7WG2D,1-AsSVP采用三亲杂交法转入农杆菌LBA4404中。
　　4.采用蘸花法侵染野生型拟南芥，经PCR、RT-PCR等分子检测显示，外源基因已成功导入拟南芥基因组DNA中，并在转录水平得到表达。对转基因株系的表型观察结果显示，AsFUL基因过表达株系的开花时间明显提前，早于野生型植株约7天，且花器官形态发生变异，花瓣转换为萼片，并有少部分花朵出现5枚花瓣，表明了AsFUL基因为开花促进因子，并且参与调控花器官的形态建成；AsSVP基因过表达株系开花时间明显延迟，晚于野生型植株约12天，叶片及分枝数明显增多，并且其下游开花相关基因FT、SOC1、LFY的表达均呈下调，表明AsSVP基因为开花抑制因子，并具有促进分枝和叶片生长的功能。

目录

1绪论

1.1被子植物开花的研究

1.2 MADS-box基因与花的发育

1.3大蒜简介

1.4研究目的和意义

1.5研究方法与技术路线

2大蒜AsFUL基因的克隆

2.1试验材料

2.2试验试剂

2.3试验方法

2.4结果与分析

2.5讨论

2.6本章小结

3大蒜AsFUL基因的序列特征与系统进化分析

3.1大蒜AsFUL基因的序列特征分析

3.2大蒜AsFUL基因的同源性分析和系统进化分析

3.3讨论

3.4本章小结

4大蒜AsFUL、AsSVP基因的表达分析

4.1试验材料

4.2试剂和仪器

4.3试验方法

4.4结果与分析

4.5讨论

4.6本章小结

5大蒜AsFUL与AsSVP基因的功能验证

5.1试验材料

5.2试验试剂

5.3试验方法

5.4试验结果与分析

5.5讨论

5.6本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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